王大虎

王大虎:蛋白质纯化的依据

能从成千上万种蛋白质混合物中纯化出一种蛋白质的原因,是不同的蛋白质在物理、化学和生物学性质方面有着极大的不同,这些性质是由蛋白质氨基酸的排列序列和数目不同造成的。连接在多肽主链上的氨基酸残基可以是带正电荷或负电荷、极性的或非极性的、亲水的或疏水的,此外多肽可折叠成非常确定的二级结构(α螺旋、β折叠和各种转角)、三级结构和四级结构,形成独特的大小、形状和残基在蛋白质表面的分布状况。

蛋白质可以进行分离纯化的主要依据是蛋白质本身的理化性质,如溶解度、分子大小及形状、密度、电离性质、亲水性、配位吸附特异性、生物学功能等,详述如下。

(一)溶解度差异

利用蛋白质溶解度的差异是分离纯化各种蛋白质常用的方法。影响蛋白质溶解度的外界因素很多,其中主要有:溶液的pH、离子强度、介电常数和温度,在同一特定外界条件下,不同的蛋白质具有不同的溶解度。适当改变外界条件,可以控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度。

依据蛋白质溶解度差异的纯化方法有盐溶、盐析、低温有机溶剂沉淀等。中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响,一般在低盐浓度下随着盐浓度的升高,蛋白质的溶解度增加,此称盐溶;当盐浓度继续升高时,蛋白质的溶解度有不同程度的下降并先后析出,这种现象称为盐析。将大量盐加到蛋白质溶液中,高浓度的盐离子(如X铵的和)有很强的水化力,可夺取蛋白质分子的水化层,使之“失水”,于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同,故盐析所需的盐浓度也不一样,因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。

王大虎
王大虎

有机溶剂可用于沉淀蛋白质的原因有二:一、有机溶剂与盐溶液一样,可使蛋白质失水;二、有机溶剂的介电常数比水小,导致溶剂的极性较小。蛋白质在不同的溶剂中的溶解度有很大不同,从基本不溶(<10µg/mL)至极易溶解(>300mg/mL)不等。而同一有机溶剂引起不同蛋白沉淀的浓度也不同。故控制有机溶剂的浓度不同可分离蛋白质,常用的有机溶剂有甲醇、乙醇和丙酮等。由于有机溶剂加入水溶液中产生放热反应会引起蛋白变性。因此有机溶剂必须先在-10℃下预冷,并且整个操作过程都应在低温下进行,所以称为低温有机溶剂沉淀法。

(二)等电点差异

蛋白质的等电点(isoelectric point, pI)是指使蛋白质分子所带正电荷与负电荷相等(即净电荷为零)时溶液的pH,由蛋白质上带正、负电荷的氨基酸残基数目和滴定曲线所决定。蛋白质pI一般在4.0~10.0。当pH>pI时,蛋白质带负电荷;当pH<pI时,蛋白质带正电荷;当pH=pI时,蛋白质所带净电荷为零。

依据此性质,可以在蛋白质的分离纯化中用等电点沉淀法和pH控制。蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小,因而溶解度也最小,各种蛋白质的等电点有差别,可利用调节溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉淀。但此法很少单独使用,可与盐析法结合应用(详见第三章)。

(三)分子质量不同

蛋白质分子质量的大小各不相同,可从只含几个氨基酸的小肽(分子质量只有几百u)至含有10000多个氨基酸的巨大蛋白质(分子质量超过1000000u)不等。多数蛋白质的分子质量在10000~150000u。有的蛋白质是多亚基复合物的一个部分,它们的分子质量就可能比较大。

依据蛋白质此性质,在蛋白质分离纯化过程中所采用的方法有透析、超滤、离心和凝胶过滤层析。

透析和超滤是利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质,使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖、水等分开。透析是将待提纯的溶液装入半透膜的透析袋内,透析袋置于蒸馏水中,更换透析外液,直到透析袋内的无机盐等小分子物质浓度降到最低为止。超滤是利用压力或离心力,迫使水和其他小分子溶质通过半透膜而使蛋白质保留下来。可以选择不同截留分子质量的超滤膜,将分子质量不同的蛋白质分离(详见第四章)。

根据蛋白质分子大小、形状不同进行分离的技术称为离心法。离心法主要包括差速离心法和速度区带离心法。差速离心法是通过逐渐增加离心速度,使样品中沉降速度不同的颗粒逐步分离开来。该法主要适用于分子质量或沉降系数相差较大的颗粒,一般用作粗分离,如从组织匀浆液中分离细胞器及分离病毒。速度区带离心法的沉降速度主要取决于颗粒的形状和大小,一般用蔗糖、聚蔗糖等作为密度梯度介质。离心时间的选择非常重要,时间太长颗粒全部沉入管底;离心时间太短,则颗粒之间未完全分开。

凝胶过滤层析又称分子筛层析,是根据分子大小分离蛋白质混合物的有效方法之一(详见第六章)。

(四)密度差异

多数蛋白质的密度为1.3~1.4g/mL,分级分离蛋白质时一般不常用此性质,不过针对含有大量磷酸盐或脂质的蛋白质与一般蛋白质在密度上明显不同,可用密度梯度法离心使其与大部分蛋白质分离。

(五)电荷不同

蛋白质的净电荷取决于氨基酸残基所带正、负电荷的总和。一个蛋白质分子中,若天冬氨酸和谷氨酸残基占优势,在pH7.0时带净负电荷,称为酸性蛋白质;若赖氨酸和精氨酸残基占优势,则认为是碱性蛋白质。若带电与不带电基团之间平衡,则蛋白质的电荷由溶液的pH决定。

根据蛋白质电荷不同,即酸碱性质不同分离蛋白质的方法主要有电泳和离子交换层析。电泳的种类很多,有X电泳、区带电泳、等电聚焦电泳、双向电泳和毛细管电泳等(详见第五章)。离子交换层析法的依据是:由于被分离蛋白质的各种离子所带电荷的多少不同,它们对交换剂的亲和力就有差异,因此通过离子交换层析分离时,经过离子的交换与洗脱过程,不同的离子依先后顺序被洗脱下来,从而达到分离目的(详见第六章)。

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