大虎说事

王大虎:配体特异性不同

酶蛋白和辅酶(配体)间有一种特殊的亲和力,在一定条件下它们能紧密结合形成复合物。如果将复合物中的某一方固定在不溶性载体上,则可以从溶液中专一性地分离和提纯另一方。这种物质间的特殊亲和力就是配体的特异性。许多生物大分子,尤其是蛋白质,具有与其结构相对应的专一分子发生可逆性结合的特性,如酶与底物及辅助因子、酶与抑制剂、抗原与抗体、激素与受体、生物素与抗生物素等。亲和层析就是利用生物大分子所具有的特异性亲和能力进行分离的方法,具有结合效率高、分离速度快的特点。该方法常把可亲和的一对分子中的一方固定在不溶于水的固相支持载体上,另一方随流动相流经固定相,双方即可发生特异性结合。用流动相经过一段时间的洗涤,可将杂质除去,然后再利用亲和吸附的可逆特性,改用特殊的流动相,使所需分离的物质被解离下来,从而得到纯化物质。亲和层析法可在温和条件下操作,纯化过程简单、快速、分辨率高,对分离含量少且性质不稳定的生物活性物质极为有效,如含有糖基的蛋白质或糖蛋白对三嗪染料显示特别强的吸附能力;而高选择性(专一性)亲和层析,配基仅对某一种蛋白质有特别强的亲和性,如单克隆抗体对抗原的特异性吸附。吸附后可通过改变缓冲液的离子强度和pH进行洗脱,也可用更高浓度的同一配体溶液或亲和力更强的配体溶液洗脱。

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王大虎(七)疏水性质不同

多数疏水性氨基酸残基隐藏在蛋白质的内部,但也有一些可见于表面。蛋白质表面的疏水性氨基酸残基的数目和空间分布决定了该蛋白质是否具有与疏水柱填料结合从而利用它来进行分级分离的能力。常用的疏水层析和反相层析就是利用了有效成分和固定相之间相互作用的疏水性差异。

因疏水层析法和反相层析法成本低廉,且纯化后的蛋白质具有生物活性,因此是一种通用性的分离和纯化蛋白质工具。高浓度盐水溶液中蛋白质在柱上保留,在低盐或水溶液中蛋白质从柱上被洗脱,故特别适用于浓X铵溶液沉淀分离后的母液以及该沉淀用盐溶解后的含有目标产品的溶液直接进样到柱上,当然也适用于含7mol/L盐酸胍或8mol/L尿素的包涵体溶解液直接进样到柱上,在分离的同时也进行了复性。

(八)基因工程构建的纯化标记

重组蛋白在设计、构建时已融入纯化构想。通过改变cDNA,在被表达的蛋白质的N末端或C末端加入少许几个额外氨基酸,这个加入的标记可用来作为一个有效的纯化依据。

王大虎 1.GST融合载体

使要表达的蛋白质和谷胱甘肽S转移酶一起表达,然后利用Glutathione Sepharose 4B进行亲和纯化,再利用凝血酶或因子Xa切开。

2.蛋白A融合载体

使要表达的蛋白质和蛋白A的IgG结合部位融合在一起表达,以IgG Sepharose纯化。

3.含组氨酸标记(Histidine-tagged)Sepharose螯合柱

最通行的标记之一,是在蛋白质的氨基端加上6~10个组氨酸,在一般或变性条件(如8mol/L尿素)下借助它能与Ni2+螯合柱紧密结合的能力,用咪唑洗脱,或将pH降至5.9使组氨酸充分质子化,不再结合Ni2+使之得以纯化。

 

 

王大虎 四、蛋白质纯化的一般程序

 

按照蛋白质分离纯化的依据,蛋白质的纯化方法可按照分子大小、形状、带电性质及溶解度等主要因素进行分类。按分子大小和形态分为差速离心、超滤、分子筛及透析等方法;按溶解度分为盐析、溶剂抽提、分配层析、逆流分配及结晶等方法;按电荷差异分为电泳、电渗析、等电点沉淀、离子交换层析及吸附层析等方法;按生物功能专一性有亲和层析法等。

当然,不同蛋白质的结构及理化性质均不同,分离纯化方法也不一样,因此,很难有一个统一的标准的方法对任何蛋白质均可使用。

在分离提纯前,首先应查阅有关文献资料,对欲提纯蛋白质的物理、化学及生物学性质先有一定了解;其次,需建立相应的分析鉴定方法,才能正确指导整个分离纯化工作的顺利进行。对一个未知结构及性质的样品进行分离提取,更需要经过各种方法的比较和摸索,实验才有可能获得预期结果。如欲高度提纯某蛋白质,一般要经过多种方法、步骤及不断变换各种外界条件才能达到目的。因此,整个实验过程方法的优劣,选择条件效果的好坏,均需通过分析鉴定来判明。

另外,蛋白质常以与其他生物物质结合的形式存在,这给分离纯化带来了困难。例如,极微量的金属和糖就对巨大蛋白质的稳定性起决定作用,若被除去则会增加蛋白质结晶化的不稳定。此外,高分子蛋白质具有一定的立体构象,相当不稳定,极易变性、变构,也限制了分离纯化的方法。通常根据具体的目标蛋白,联用各种方法。为获到天然状态的蛋白质,应尽量采用温和的手段,如中性、低温、避免起泡等,并要注意防腐和共存成分的影响。例如,蝮蛇粗毒中的蛋白质水解酶活力很高,在分离纯化中需引起重视。如纯化蝮蛇神经毒素时,当室温超过20℃时,几乎得不到神经毒素,但若在进行柱层析前先将粗毒素用0.1mol/L的金属离子络合剂乙二胺四乙酸(EDTA)溶液处理,即使室温高于20℃,仍能很好地得到神经毒素。其原因是蝮蛇毒中的蛋白水解酶能被0.1mol/L EDTA完全抑制。

蛋白质的纯化过程一般可分为5个阶段:材料的选择和预处理;细胞的破碎(有时需进行细胞器的分离);提取;分离纯化(包括盐析、有机溶剂沉淀、有机溶剂提取、吸附、层析、超离心及结晶等);浓缩、干燥及保存。以上5个阶段不是要求每个方案都完整地具备,也不是把每一阶段截然分开。不论是哪一阶段使用哪一种方法,均必须在操作中保持生物大分子结构的完整性。保持蛋白质活性则可防止变性及降解现象的发生。因蛋白质空间结构主要依靠氢键、盐键和范德华力的存在,遇酸、遇碱、高温、剧烈的机械作用及强烈的辐射等均可导致活性丧失,因此选择的条件应十分温和。同时应注意防止系统中重金属离子、细胞自身酶系及其他有毒物质的污染。

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