王大虎

王大虎:材料的选择和预处理

王大虎选择材料主要根据实验目的而定。工业生产上应选择蛋白质含量高、来源丰富、易获得、制备工艺简单、成本低的动植物组织或微生物作原料。科研选材则无需考虑上述问题,只要能达到实验目的即可。

实验材料选定后,常常需要进行预处理,如动物材料需要除去一些与实验无关的结缔组织、脂肪组织;植物种子需要除壳;微生物需要将菌体与发酵液分开。另外,必须尽可能保持材料的新鲜,尽快加工处理。若不立即进行实验或加工,应冷冻保存。

(二)细胞破碎

分离提取某一生物大分子,首先要求生物大分子从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来,并保持原来的天然状态,具备生物活性,因此应选择适当的方法将组织和细胞破碎。但若材料是X(如血液)或生物体分泌到体外的分泌物,则不必进行组织细胞的破碎。

组织细胞的破碎方法有很多,不同的实验规模、材料和要求,使用的破碎方法和条件也不同。一般动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆器破碎,或也可用超声波处理破碎。植物组织和细胞由于具有纤维素、半纤维素和果胶等物质组成的细胞壁,一般常用石英砂和适当的提取液一起研磨的方法破碎,或用纤维素酶处理也能达到目的。细菌细胞的破碎比较困难,因为整个细菌细胞壁的骨架实际上是借共价键连接而成的肽聚糖囊状大分子,非常坚韧,破碎的方法常有超声波震荡、石英砂研磨、高压挤压或溶菌酶处理(以分解肽聚糖)。

如果要分离制备分布在细胞核、线粒体、核糖体、内质网等细胞器(植物细胞还有叶绿体)中的生物大分子,为了防止其他细胞组分中的物质对制备物的干扰或污染,还需先将细胞器分离出来,然后在某一细胞器中分离某一物质。

细胞器的分离一般采用差速离心法,即将破碎后的细胞在适当的介质中进行离心,常用的介质有蔗糖、甘露醇、柠檬酸、聚乙二醇(PEG)等。各种细胞组分按质量大小的不同,经过不同速度的离心后,沉降于离心管的不同部位,经多次分步离心后,即可获得所需组分。

王大虎(三)提取

组织细胞破碎过程中,大量的胞内酶及细胞内含物被释放出来,必须立即将其置于一定条件下和溶剂中,让制备物充分溶解,并尽可能保持原来的天然状态,避免因长久放置造成制备物的分解破坏,这就是提取。

大多数蛋白质均能溶于水、稀盐、稀碱或稀酸溶液中,故蛋白质的提取一般以水溶液提取为主。通常采用类似生理条件下的缓冲液,如20~50mmol/L的磷酸盐缓冲液(pH7.0~7.5)或0.1mol/L Tris-HCl(pH7.5~8.0)缓冲液。对于一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性较多的蛋白质和酶,不溶于水、稀盐、稀碱、稀酸,常在提取液中加入适量的有机溶剂,如乙醇、丙酮、异丙醇、正丁醇等。

十二烷基X钠(SDS)等阴离子去垢剂能与蛋白质带正电荷的侧链结合,从而使核酸与蛋白质分开。然后加入浓醋酸钾溶液,使SDS-蛋白质复合物沉淀,并使多余的SDS转化为溶解度小的钾盐而同时沉淀。

酚、氯仿等有机溶剂混合液作为蛋白质的变性剂,当它们与含核酸和蛋白质的水溶液一起振摇时形成乳状液,蛋白质因充分接触酚和氯仿而变性,与核酸分开。离心后可分为两相,一般上层为含核酸的水相,下层为有机相,交界处是变性凝聚的蛋白质层。有机溶剂沉淀法可以作为研究变性凝聚的蛋白质的抽提方法。

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(四)分离纯化

从细胞中提取得到的蛋白质分子往往是不纯净的,含有大量杂质,必须进一步分离纯化,这一阶段可分为粗分级分离和细分级分离两步。原则上一般是从低分辨率到高分辨率,尽可能地减少分离纯化的步骤。

王大虎1.蛋白质的粗分级分离

分离纯化初期,由于提取液中的物质组成十分复杂,制备的物质浓度很低,在理化性质上与被制备物相似的杂质数量较多,因此在这一阶段宜选用一些高处理量、低成本和分辨能力较低的分离纯化方法,如有机溶剂沉淀、盐析、有机溶剂萃取、吸附等,这样在分离纯化的同时,还可以起到浓缩的作用,利于后面的纯化工作的进行。

另外,离子交换色谱和亲和柱色谱有时也用于初期纯化,但是位置一般稍靠后。

2.蛋白质的细分级分离

一般蛋白质样品经粗分级分离后,体积较小,杂质大部分被除去。进一步提纯,通常使用高分辨率的柱层析及电泳方法。常用的柱层析方法有分子筛层析、离子交换层析、疏水吸附层析、亲和层析等。常用的电泳方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳等。

另外,结晶也是蛋白质分离纯化的方法之一,制备的结晶物常用于蛋白质结构分析。

大致说来,纯化技术顺序的选择上,一般先使用沉淀技术,然后依次是离子交换、亲和色谱,最后是凝胶过滤,这样,每一种技术利用了蛋白质的不同性质。沉淀技术能处理大量的高浓度蛋白质溶液,离子交换除去大部分杂蛋白以便进入亲和色谱柱,凝胶过滤用于最后纯化环节,这时处理量已不是问题。但是,这并非是固定不变的纯化蛋白质的最佳方案,比如有时凝胶过滤就用作最早的分离步骤,以便获得多组分酶中的高或低分子质量部分。

蛋白质在组织或细胞中是以复杂的混合物形式存在,每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质,因此至今还没有单独或一套现成的方法能够把任何一种蛋白质从复杂的混合蛋白质中提取出来,需要采取几种方法联合使用。

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