王大虎

王大虎:蛋白质纯化方案的设计与评价

王大虎:    蛋白质纯化的总目标是设法增加蛋白质样品的纯度或比活力,对纯化的要求是以合理的效率、速度、收率和纯度,将需要的蛋白质从细胞的全部其他成分,特别是不想要的杂蛋白中分离出来,同时仍保留它该有的生物学活性和化学完整性。

纯化方案是指在纯化某一物质过程中,将几种分离方法(如沉淀法、离子交换层析、葡聚糖凝胶等)有机地互补联合、灵活应用的总称。它既是从各类材料中提取分离有效成分的前提,又是成功地达到纯化目的的保证。纯化方案设计合理、实用,就能事半功倍。本部分主要叙述蛋白质纯化方案的设计和评价。

(一)蛋白质纯化方案的设计

蛋白质纯化方案的设计,除要考虑利用蛋白质不同的特性外,步骤还应尽可能少,尽量使分离产物不需进一步处理就可以直接进行下一步操作。

鉴于纯化方案是由几种分离方法组成的,因此,设计纯化方案时,首先要选择分离方法。一般选择分离方法的依据,多半是从提取液中有效成分和杂质之间理化性质的差异考虑的。例如沉淀法是从有效成分和杂质之间的溶解度差异性着眼的;而离子交换层析法、凝胶过滤法和亲和层析法是从有效成分和杂质之间电荷、分子质量和对配体亲和力的差异性分析的。根据这个原理,为提取纯化某一有效成分可从诸多方法中挑选出两种或两种以上分离方法组成一个纯化方案。其中分离方法的排布,一般应当先选用粗放、快速、有利于缩小样品体积和后工序处理的方法,而精确、费时和需样品量少的方法,则适宜后选择用。虽然分离方法种类繁多,基本原理各不相同,操作程序有繁有简,利弊得失有多有少,但是,只要认真分析有效成分的特点和结构,深入理解各种分离方法的原理和用途,合理、巧妙地设计纯化方案,就能从复杂的抽提液中提取纯化出单一的有效成分。最后还应注意的是,通常在一个纯化方案中,切忌一种分离方法重复使用,否则不但不能提高纯化倍数,反而会降低收率。

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王大虎:蛋白质纯化方案设计的基本原则包括:

首先了解待纯化样品中目的蛋白质及主要杂质的性质,更要收集最重要的蛋白质杂质的有关信息以及有用的数据,如分子大小、等电点、溶解度、电荷、吸附性质、对配体分子的生物亲和力,这有助于设计蛋白质纯化方案。不同的蛋白质的性质,就一定程度地决定了该使用何种分离方法。比如若目的蛋白是糖蛋白或脂蛋白,它们就明显区别于大多数杂蛋白;蛋白质是在细胞内还是细胞外、可溶还是不可溶等都将影响到蛋白质提取方法的选择和缓冲液的组成。对于细胞外蛋白质,除去细胞有助于纯化过程,与膜结合的蛋白质需要用有机溶剂先溶解。

设计一种未知蛋白质的纯化方案,很重要的是设定纯度、数量以及生物活性的目标,同时给整个工作限制一个经济和时间上的框架。目的蛋白的用途将决定纯化后的蛋白质纯度,纯化过程中允许损失多少活性以及纯化过程需要多少时间和成本。如应用于科学研究,对分辨度具有较高要求,可以牺牲收率,不计成本;临床研究或者生产规模的应用由于用量较大,成本的问题就上升到重要位置,原材料的来源、杂质的含量以及靶蛋白质含量的多少都需要认真考虑。纯蛋白质的数量不仅受原材料数量的影响,还受到蛋白质纯化收率的影响。在有不同原料可供选择时,一般选用目的蛋白质最稳定、含量最丰富的,同时也考虑获得原料是否容易,数量是否足够多,成本是否比较低。在纯化过程中,每一步骤都会损失蛋白质,所以纯化步骤应尽量少,以得到高蛋白质收率。但是纯化步骤的减少会降低目的蛋白的最终纯度,需要恰当选择各种纯化方法以提高蛋白质收率。

充分了解各分离纯化技术操作单元的大量信息也很重要,比如在细胞破碎时,需要了解细胞破碎方法从而了解其流速、搅拌器类型、操作压力、细胞浓度和种类、产品释放的碎片和大小等;设计分析吸附色谱时,要了解色谱柱特征、凝胶或其他吸附剂的性能(如结合能力、解离常数、流速等)。

除此之外,有了蛋白质性质等相关信息及对分离纯化技能、知识的了解和掌握后,还要根据自身的经费、财务状况以及所拥有的科研力量(包括设备、人员和厂房标准)来合理安排纯化方案。

王大虎:(二)蛋白质纯化方案的评价

蛋白质纯化方法选择的最终目的是使蛋白质纯化后收率、纯度最高,成本最低。那么应该如何评价一个纯化方案的可实现性呢?对纯化方案的评价,实质是对组成纯化方案的每一种纯化方法的评价。鉴定指标是,对纯化过程的每一步收集的溶液都进行有效成分的含量测定,即比活力、纯化倍数和收率的测定和计算。纯度越高,比活力越高,纯化倍数越高,收率降低。一般根据纯化倍数的大小和收得率的高低,便能初步确定每种分离方法的应用价值。凡是在特定实验中能增大纯化倍数和提高收得率的方法均属有应用价值;反之,则应用价值不大,也不宜采用。但是,在纯化过程中,随着纯化倍数的增大,有效成分的含量却是逐渐减少,收得率也往往小于100%(除非提取液中存在酶的抑制)。因此,实践中对纯化倍数和收率的要求是根据材料来源的难易而变化。若材料来源难,就希望提高收率;反之,则希望提高纯化倍数(见沉淀法)。下面以赛氏杆菌提取L-门冬酰胺酶为例,说明纯化方案与纯化倍数和收得率的关系,如表0-1所示。

从表0-1看出,分离纯化操作是一个比较复杂的过程,欲从赛氏杆菌提取分离出L-门冬酰胺酶需要分7步完成,其中包括细胞破碎、选择性沉淀、X铵分离、离子交换层析、吸附层析、凝胶电泳等方法。也就是说,这个纯化方案是由7种分离方法组合起来的,从粗酶液(粗提取液)到纯酶液每步的纯化倍数都在有序增加,最后的纯化倍数为365,而每步的收率却都在逐渐下降,最后的收率仅为15%,其中损失占85%。这些数据反映出本纯化方案中所列分离方法的选择、组合和排列是适当的,在此期间,蛋白质总量降低为1/2500,而酶总活力只降低为1/6.7。这表明杂蛋白比酶蛋白降低快得多,因而L-门冬酰胺酶得到了纯化。此处酶含量是用活力单位表示,纯度用比活力表示,如纯化的物质是胰岛素,其含量应用效价表示,纯度用每毫克蛋白质所含效价单位表示。总之,纯化的有效成分不同,表示其含量和相对纯度的单位也不一样。

 

 

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