王大虎

王大虎:蛋白质提取的影响因素

一、缓冲液

 

能抵御少量的酸、碱,或稀释少量倍数时,X的pH基本不变的溶液称为缓冲溶液。缓冲溶液的缓冲对一般是由共轭酸碱对或两性物质组成。缓冲液可以抗衡蛋白质溶液中pH的改变,选择合适的缓冲液对于维持一定pH下蛋白质的稳定及保证实验的可重复性十分重要。pH和pKa是描述缓冲液的两个重要概念。pH是指溶液中氢离子浓度的负对数,pH=-lg[H+]。pKa是溶液中酸解离常数的负对数值。溶液的pH与pKa越接近,表明溶液的缓冲能力越强,离pKa越远则表明溶液的缓冲能力越弱。常用缓冲液的pKa如表1-1所示。

表1-1 常用缓冲液的pKa

 

王大虎:(一)选择缓冲液的一般原则

①有条件时,应对pKa相近的一些缓冲液进行实验,以避免有的缓冲液与所研究的蛋白质之间发生不良的相互作用。

②当选定一种缓冲液之后,一般使用其最低的浓度以避免非特异性离子强度的影响。通常以50mmol/L的缓冲液浓度作为实验起始浓度。

③当缓冲液pKa的变化超过1个pH单位时其有效缓冲能力明显降低,而许多酶在极限pH时往往发生不可逆的变性。

④大多数动物细胞在37℃的生理状况下pH为7.0~7.5,而在温度下降至接近0℃时可达8.0。

⑤要根据所选用的分离方法选用缓冲液:对于凝胶过滤方法,大多数缓冲液均可适用;对于阴离子交换层析,阳离子缓冲液首选Tris缓冲液;对于阳离子交换和羟基磷灰石层析,阴离子缓冲液首选磷酸盐缓冲液。

⑥混合缓冲液在一定的离子强度下往往具有更宽的缓冲范围。

⑦考虑在低温时缓冲液和冰点溶剂的情况。

⑧所采用的化学试剂应达到分析纯级或更高纯度要求。

 

王大虎:(二)常用缓冲液的配制

1.磷酸盐缓冲液

磷酸盐(NaH2PO4和Na2HPO4)是使用最广泛的一种缓冲剂,由于它们是二级解离,有两个pKa值(NaH2PO4:pKa1=2.12,pKa2=7.21;Na2HPO4:pKa1=7.21,pKa2=12.32),所以用磷酸盐配制的缓冲液pH范围最宽:配制酸性缓冲液:用NaH2PO4,pH=1~4;配制中性缓冲液:用混合的两种磷酸盐,pH=6~8;配制碱性缓冲液:用Na2HPO4,pH=10~12。磷酸盐缓冲液的配制如表1-2所示。

表1-2 磷酸盐缓冲液的配制  单位:%

 

注:①储存液A:0.2mol/L Na2HPO4,71.6g Na2HPO4·12H2O溶于1L去离子水中;

②储存液B:0.2mol/L NaH2PO4,31.2g NaH2PO4·2H2O溶于1L去离子水中。

用钾盐比钠盐好,因为低温时钠盐难溶,钾盐易溶,但若配制SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的缓冲液,只能用磷酸钠而不能用磷酸钾,因为SDS会与钾盐生成难溶的十二烷基X钾。

磷酸盐缓冲液的优点为:①容易配制成各种浓度的缓冲液;②适用的pH范围宽;③pH受温度的影响小;④缓冲液稀释后pH变化小,如稀释10倍后pH的变化小于0.1。其缺点为:①易与常见的Ca2+、Mg2+以及重金属离子缔合生成沉淀;②会抑制某些生物化学过程,抑制多数酶的活力,包括对激酶、磷酸化酶、脱氢酶和以磷酸酯为底物的酶的催化作用都会产生某种程度的抑制作用。

2.Tris[三羟甲基氨基甲烷,N-Tris(hydroxymethyl)aminomethane]缓冲液

Tris缓冲液的有效pH范围属于“中性”范围,例如,Tris-HCl缓冲液:pH=7.5~8.5;Tris-磷酸盐缓冲液:pH=5.0~9.0。

Tris缓冲液常用配制方法为:若配制1L 0.1mol/L Tris-HCl缓冲液,先称12.11g Tris碱溶剂溶于950~970mL去离子水中,边搅拌边滴加4mol/L HCl,用pH计测定溶液pH至所需的值,然后再加水补足到1L。

Tris-HCl缓冲液的优点是:①因为Tris碱的碱性较强,所以可以只用这一种缓冲X配制pH范围由酸性到碱性的大范围pH的缓冲液;②对生物化学过程干扰很小,不与Ca2+、Mg2+及重金属离子发生沉淀。其缺点是:①缓冲液的pH受溶液浓度影响较大,缓冲液稀释10倍,pH的变化大于0.1;②温度效应大,温度变化对缓冲液pH的影响很大,例如:4℃时缓冲液pH=8.4,而37℃时pH=7.4,所以一定要在使用温度下进行配制,室温下配制的Tris-HCl缓冲液不能在0~4℃使用;③易吸收空气中的CO2,所以配制的缓冲液要盖严密封;④此缓冲液对某些pH电极有一定的干扰作用,所以要使用与Tris溶液具有兼容性的电极。

大虎说事
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王大虎:3.有机酸缓冲液

有机酸缓冲液多数是用羧酸与它们的盐配制而成,pH范围为酸性,即pH=3.0~6.0,最常用的是甲酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸等。

甲酸-甲酸盐缓冲液应用范围很广,因其挥发性强,使用后可以用减压法除去。乙酸-乙酸钠和柠檬酸-柠檬酸钠缓冲X的使用也较多,柠檬酸有3个pKa值:pKa1=3.10,pKa2=4.75,pKa3=6.40;琥珀酸有2个pKa值:pKa1=4.18,pKa2=5.60。

有机酸缓冲液的缺点是:①所有这些羧酸都是天然的代谢产物,因而对生化反应过程可能产生干扰作用;②柠檬酸盐和琥珀酸盐可以和过渡金属离子(Fe3+、Zn2+等)结合而使缓冲液受到干扰;③这类缓冲液易与Ca2+结合,所以样品中有Ca2+时,不能用这类缓冲液。

4.硼酸盐缓冲液

硼酸盐缓冲液的有效pH范围是8.5~10.0,是碱性范围内最常用的缓冲液。其优点是配制方便,只使用一种试剂;缺点是能与很多代谢产物形成络合物,尤其是能与糖类发生羟基反应生成稳定的复合物而使缓冲液受到干扰。

5.氨基酸缓冲液

氨基酸缓冲液pH范围较宽,使用范围广,可用于pH2.0~11.0。最常用的有:甘氨酸-HCl缓冲液:pH=2.0~5.0;甘氨酸-NaOH缓冲液:pH=8.0~11.0;甘氨酸-Tris缓冲液:pH=8.0~11.0(此缓冲液广泛用于SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的电极缓冲液);组氨酸缓冲液:pH=5.5~6.5;甘氨酰胺缓冲液:pH=7.8~8.8;甘氨酰甘氨酸缓冲液:pH=8.0~9.0。

此类缓冲X的优点是:为细胞组分和各种提取液提供更接近天然的环境。其缺点是:①与羧酸盐和磷酸盐缓冲X相似,也会干扰某些生物化学反应过程,如代谢过程等;②试剂的价格较高。

6.两性离子缓冲液

两性离子缓冲液又称Good’s缓冲液。

1960年,N. E. Good和他的同事们总结了现有的各种缓冲试剂的优缺点后认为,必须用人为设计和人工合成的方法来寻找专门用于生命科学研究的特定的缓冲X。Good’s缓冲液的主要优点是:不参加和不干扰生物化学反应过程,对酶化学反应等无抑制作用,所以专门用于细胞器和极易变性的、对pH敏感的蛋白质和酶的研究工作。其缺点是:①价格昂贵;②对测定蛋白质含量的双缩脲法和Lowry法不适用,因为它们会使空白管的颜色加深。

(三)缓冲液配制与使用时的注意事项

缓冲液在配制与使用时受温度、无机成分和浓度的影响,而且要防止缓冲液受污染。

缓冲液的pH随温度的变化而变化。蛋白质的纯化工作通常在4℃(如冷房)进行,然而缓冲液pH的调节通常是在室温下完成的,这时温度对pH的影响比较大,尤其是Tris缓冲液,25℃时pKa为8.06,而0℃时pKa变为8.85。配制时应该按照缓冲液使用时的pH适当校正温度所导致的变化值。

一般使用HCl或NaOH、KOH来调节缓冲液的pH。在反应中如果要彻底避免一价、二价或三价金属离子的干扰,可以用羟化四甲铵来调节缓冲液的pH,因为羟化四甲铵的碱性与NaOH、KOH相当。

配制缓冲液时应当在加入所有的成分[如EDTA、二硫苏糖醇(DTT)、Mg2+等]后再测pH,因为这些成分的加入可能改变溶液的pH。缓冲液中的无机成分(磷酸盐、硼酸盐、碳酸盐)可以与酶或其底物反应,从而影响酶的活力。有些缓冲液与二价或三价金属离子(如Ca2+、Mg2+、Fe3+等)形成配位复合物,释放出质子,降低了溶液的pH,则缓冲液对氢离子的缓冲能力将明显地降低;或螯合金属离子产生不溶性复合物。因此,在研究一些具有金属离子要求的酶时,需采用与金属结合力低的缓冲液,如PIPES、TES、HEPES和CAPS等。由于带有哌嗪基的缓冲液(如Hepes、EPPS)在多数情况下可形成X基团,因而在氧化还原反应中应避免使用这些溶液。

浓度对缓冲液pH的影响表现为在稀释高浓度的储存液时有可能会改变溶液的pH。例如,pH6.7、0.1mol/L的NaH2PO4溶液在10倍稀释后pH为6.9,在100倍稀释后pH变为7.0;Tris缓冲液每稀释10倍pH降低0.1。通常配制的缓冲液是10×和100×的储存液,以使储存液的体积变小,并允许加入抑菌剂(如0.02%的叠氮化钠)。所以,在配制低浓度的缓冲液时应该按照缓冲液使用时的pH适当校正稀释所导致的变化值。

在配制与使用过程中为了防止缓冲液受污染,经常采用以下措施:磷酸盐缓冲液很容易受微生物污染,而1mol/L的磷酸盐溶液却不易被细菌污染;无菌过滤可有效防止细菌和真菌的污染,尤其在pH6~8时;将缓冲液放在冰箱里保存可有效减少细菌的污染;在缓冲液中加入0.02%(3mmol/L)叠氮化钠可有效防止储存缓冲液的污染,这一浓度下通常不会干扰蛋白质的活性。

缓冲液的组成中,水是最基本的成分。蒸馏及去离子过程中可去除水中的许多杂质成分,但仍可能有痕量的杂质存在并影响蛋白质溶液,因而在实验研究中需要利用高纯度水处理系统进行水的纯化。应使用去离子水或重蒸水配制缓冲液。

 

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