王大虎

王大虎:温度和溶液极性和离子强度

不同的蛋白质在不同的温度下具有不同的溶解度和活性。大多数蛋白质在低温(如0℃左右)下比较稳定,故分离操作一般在0℃或更低温度下进行。例如,在生产人绒毛膜X(HCG,一种糖蛋白)制品时,一定要在低温下进行。当温度低于8℃时,从200kg孕妇尿中可提取约100g人绒毛膜X粗品(比活力为160U/mg),而当温度高于20℃时,从400kg孕妇尿中提取的粗品质量还不到100g,而且比活力很低。另外,高温下制备的人绒毛膜X粗品很难进一步纯化至3500U/mg,原因是高温会使人绒毛膜X受到微生物和(或)糖苷酶的破坏。但是,有些物质对温度的要求却与此不同。例如,从鸟肝分离出的丙酮酸羧化酶对低温十分敏感,25℃时才稳定。还有一种有机磷农药水解酶,置于-10℃时会快速失活;移至21℃下2d后开始失活,此后每天失活剩余的16%;若将其存放于6℃,失活速度则较缓慢,每天约丧失活力0.75%。究竟什么温度对提取什么类型的蛋白质有利,要从实践中摸索探讨,切忌生搬硬套。

在蛋白质提取液中通常包含0.1~0.2mol/L的KCl或NaCl来模拟生理状况下的离子强度。一般来说,离子强度较低的中性盐溶液有促进蛋白质溶解、保护蛋白质活性的作用,离子强度过高则会引起蛋白质发生盐析作用。但是,蛋白质的性质各不相同,有些蛋白质在极性大、离子强度高的溶液中稳定;有些则在极性小、离子强度低的溶液中稳定。例如提取伴刀豆球蛋白时,用0.15mol/L甚至更高浓度的NaCl溶液,都可使其从刀豆粉中溶解出来,并稳定存在;而抽提脾磷酸二酪酶时,则须用0.2mol/L蔗糖水溶液才能达到提取目的。

通常降低极性的方法是在水溶液中增加蔗糖或甘油的浓度。若用二甲基亚砜(DMSO)或二甲基甲酰胺代替蔗糖或甘油时,会使溶液的极性大大降低。在水溶液中加入中性盐如KCl、NaCl、NH4Cl和(NH4)2SO4能提高溶液的离子强度。常用的盐溶液是NaCl溶液,浓度以0.15mol/L为宜。但是在提取X白或与细胞器结合的蛋白质时,为促使蛋白质与核酸或细胞器分离,则宜用高浓度(0.5~2.0mol/L)的盐溶液。黏多糖类物质也溶于高离子强度的盐溶液。若用有机溶剂提取蛋白质等物质时,加入少量的中性盐也可使其稳定。

王大虎
王大虎

溶液中的金属离子影响所提取蛋白质的活性和稳定性。如果蛋白质的活性或稳定性需要金属离子来维持,这时应当注意缓冲液对金属离子的亲和性,避免使用Tris缓冲液作为提取液。在100mmol/L Tris缓冲液中加入2mmol/L Mn2+则29%的金属离子被螯合。

蛋白质的羟基除易受氧化剂作用外,还能和金属离子如铅、铁或铜作用,产生沉淀复合物。金属离子的沉淀可能导致蛋白质活性的丧失。这些金属离子主要来源于制备缓冲液的试剂,当提取液中的金属离子干扰所提取蛋白质的活性和稳定性时,应在蛋白质提取液中加入特异金属离子的螯合剂,同时应注意金属离子螯合剂同时能使金属蛋白酶失活。原则如下:

①为了去除缓冲液中存在的痕量重金属离子,可在其中加入0.1~5mmol/L的EDTA。

②最常用的金属离子螯合剂为EDTA和乙二醇-双-(2-氨基X)四乙酸(EGTA)。EDTA对大多数金属离子有非特异的亲和性;而EGTA对Ca2+有很强的亲和性,明显高于对Mg2+的亲和力,使用EGTA可有效去除溶液中的Ca2+。

③邻二氮杂菲可螯合Zn2+,而间-邻二氮杂菲则不可螯合Zn2+。

请注意,缓冲液pH没有在7.0以上的情况下,这些螯合物的游离酸形式是不溶于水的。所以应在调节pH前将螯合物加入缓冲液,也可以用螯合物的二价钠盐或钾盐,但它们会给溶液加入钠离子。提取缓冲液中所需螯合物的浓度因所用组织而异,一般用2~10mmol/L较合适

在细胞中有许多种还原成分(如谷氨酰胺)可防止蛋白质氧化,但是一旦细胞破碎,由于和氧的接触以及稀释作用而引起抗氧化成分的减少,使许多蛋白质被氧化而失去活性。氧化作用可在蛋白质的若干位点上发生,尽管有时可通过减少巯基的存在使其恢复活性。因此,在蛋白质提取过程中经常会使用一些还原剂,以防止蛋白质被氧化而失去活性。特别是以某些巯基为关键活动基因的蛋白质,如果不加还原剂,对这些蛋白质的活性会有很大的影响。常用的还原剂包括β-巯基乙醇和DTT。

不应用氢硼化物之类的强还原剂,因它们会产生蛋白质的化学修饰。蛋白质含有巯基基团,可使它呈现种种不同的氧化状态,足够的还原剂浓度应能使蛋白质保持在充分还原的状态。因提取物中氧化剂的存在而引起的甲硫氨酸和色氨酸残基的氧化,也可用巯基还原剂来抑制。DTT是比β-巯基乙醇更有效的还原剂,因前者是通过分子内反应起作用的,而后者则需双分子反应。用大体积的缓冲液时,用β-巯基乙醇较省钱,尽管它的还原能力较弱一些。加入缓冲液的还原剂应是新鲜的,因为硫醇是挥发性的,且易受空气的氧化。

β-巯基乙醇通常以溶液状态储存在4℃,使用浓度为5~20mmol/L。而DDT储存液必须置于-20℃,使用浓度为0.5~1.0mmol/L。β-巯基乙醇在加入到缓冲液中24h内,可能被氧化而导致蛋白质的失活,而DDT因氧化形成稳定的分子内二硫键,并不危及蛋白质的巯基,所以不会导致蛋白质的失活。

膜蛋白的提取是蛋白质提取的一个特例。在膜蛋白的提取和纯化过程中常会用到去垢剂,在去垢剂的帮助下使膜蛋白溶解。

去垢剂是一种一端亲水一端疏水的两性双极性小分子,可在水中溶解。除了胆酸盐以外,去垢剂分子通常是由线形或带有分枝的碳氢化合物尾部和结构各不相同的亲水性头部组成。去垢剂的一个重要特性是可以形成分子团结构,成簇的去垢剂分子将亲水性的头部向外。它在水溶液中一般是以胶体粒子的形式存在。溶解的膜蛋白与去垢剂分子结合成团,膜蛋白的疏水区或穿膜区被去垢剂分子覆盖,使其能与水性缓冲液相溶。去垢剂能形成胶束的最低浓度称为临界胶束离子浓度(critical micelle concentration, CMC)大于CMC值以后去垢剂会发生不同程度上的聚集,当浓度达到一定以后甚至会单独聚集为一相。高CMC值的去垢剂在稀释时可形成单体分子,这样可通过透析迅速地去除去垢剂分子。另外,去垢剂形成的微胶粒的分子质量对于透析、凝胶过滤色谱及非变性电泳都是非常重要的。温度、pH、离子强度、多价金属离子的存在,以及有机溶剂和去垢剂的纯度均可影响去垢剂的CMC值。

理想情况下,去垢剂的选择不应该只考虑它的纯度,以及大量应用时的成本,还应该使去垢剂的用量是否足以充分溶解蛋白质而不使其发生不可逆的变性。另外,如何将多余的去垢剂从已溶解的膜蛋白碎片中分离出来是去垢剂选择的又一标准。使用去垢剂将膜蛋白从生物膜中提取出来,要综合考虑去垢剂的有效性、纯度、成本和来源等。

尽管高浓度的去垢剂往往引起蛋白质的变性,但是在去除去垢剂后可使蛋白质复性。为了避免蛋白质变性,可使用浓度低于0.1%的非离子型去垢剂。表1-3所示为常用去垢剂的特性。

表1-3 常用去垢剂的特性

 

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