大虎说事

王大虎:蛋白酶抑制剂

在提取、纯化蛋白质时,其效果常常受到本身存在的水解酶的影响。在提取蛋白质的同时破碎的细胞可释放出蛋白酶,这些酶在与欲提取的蛋白质接触时,一旦条件适宜,就会发生反应,导致蛋白质分解,使实验失败。因此,在蛋白质提取过程中,需要加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白质水解。

王大虎(一)常用抑制剂

以下列举了7种常用的蛋白酶抑制剂和它们各自的特点,因为各种蛋白酶对不同蛋白质的敏感性相同,因此需要调整各种蛋白酶的浓度。由于蛋白酶抑制剂在液体中的溶解度极低,应注意在缓冲液中加入蛋白酶抑制剂时应充分混匀,以减少蛋白酶抑制剂的沉淀。

1.苯甲基磺酰氟化物(PMSF)

①抑制丝氨酸蛋白酶(如胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、凝血酶)和巯基蛋白酶(如木瓜蛋白酶),不抑制金属蛋白酶及大部分半胱氨酸蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶;

②溶于异丙醇、乙醇、甲醇、1,2-丙二醇。在水溶液中不稳定,在100%异丙醇内,25℃稳定;

③在室温下可保存一年;

④工作浓度:0.1~1.0mmol/L;

⑤在水溶液中不稳定,必须在每一次分离和纯化步骤中加入新鲜的PMSF。

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2.乙二胺四乙酸钠(EDTA-Na2)

①抑制金属蛋白水解酶;

②溶于pH8~9的水中,溶液浓度约0.5mol/L;

③溶液在4℃下可稳定6个月以上;

④工作浓度:0.2~1.5mmol/L;

⑤需加入NaOH调节溶液的pH,否则EDTA不溶解。

王大虎3.胃蛋白酶抑制剂

①抑制酸性蛋白酶(如胃蛋白酶)、血管紧张肽原酶、组织蛋白酶L和凝乳酶;

②1mg/mL溶于甲醇中,不溶解于水;

③储存液在4℃下一周内稳定,-20℃下可稳定6个月;

④工作浓度:0.7~1µmol/L。

4.亮抑蛋白酶肽

①抑制丝氨酸和巯基蛋白酶,如木瓜蛋白酶、血浆酶和组织蛋白酶B;

②10mg/mL溶于水;

③储存液4℃下稳定一周,-20℃下可稳定6个月;

④工作浓度:0.5mg/mL。

王大虎5.胰蛋白酶抑制剂

①抑制丝氨酸蛋白酶(如血浆酶)、血管舒缓素、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶;

②10mg/mL溶于水,pH7~8,在pH>12.8时失活;

③储存液4℃下稳定一周,-20℃下可稳定6个月,避免反复冻融;

④工作浓度:0.01~0.3µmol/L。

6.抑胃肽

①抑制天冬氨酸蛋白酶(如胃蛋白酶)、肾素、组织蛋白酶D、凝乳酶和很多微生物的酸性蛋白酶;

②溶于甲醇,约1mg/mL,也可溶于乙醇或6mol/L乙酸(约300µg/mL),不溶于水,4℃下至少一周内稳定;

③工作浓度:0.7µg/mL。

7.胱蛋白酶抑制剂

①抑制半胱氨酸蛋白酶,如木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶、组织蛋白酶B和二肽酰肽酶;

②将500µg胱蛋白酶抑制剂溶解于含20%甘油的重蒸水中,-20℃冷冻,两个月内稳定;

③工作浓度:250µg/mL。

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