王大虎

王大虎:细胞的破碎

在蛋白质的提取分离过程中,常常遇到目标蛋白质存在于细胞内的情况,需要破碎细胞。事实上,除了提取细胞外成分,对细胞内及多细胞生物组织中蛋白质的分离提取均需先将细胞破碎,使其充分释放到溶液中。不同的生物体或同一生物体不同的组织,其细胞破碎难易不一,使用方法也不完全相同。如动物胰、肝、脑组织一般较柔软,用普通匀浆器磨研即可;肌肉及心组织较韧,需预先绞碎再制成匀浆。破碎方法的选择取决于破碎的对象和目的,既要考虑细胞的生理活性状态对细胞破碎的影响,又要考虑其他蛋白质或蛋白酶对目的蛋白的污染和降解,以及目的蛋白的活性。细胞破碎过程中常会产生较多的热量,应尽量保持低温,并将样品预先冷却。细胞破碎后,为防止释放的蛋白酶对目的蛋白的降解作用,最好尽快提取,也可以通过加入抑制剂或降温来减少蛋白酶的作用。常用的细胞破碎方法主要有机械破碎法、物理破碎法、化学破碎法和酶促破碎法等。在实验过程中,既可单独使用一种破碎方法,也可多种破碎方法联合使用,并控制好操作条件,以达到较好的破碎效果。

王大虎(一)机械破碎法

机械破碎法是指利用机械运动所产生的剪切力的作用使组织细胞破坏,可以分为研磨和组织捣碎两种方法。常用的细胞破碎器械有组织捣碎机、匀浆器、研钵和研磨、压榨器等。

王大虎
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1.研磨

研磨是将剪碎的动物组织置于研钵和匀浆器中,用研磨棒研碎。适用于较软的组织,如肝、肾和脑组织等。常用的研磨器械有研钵、细菌磨、匀浆器。为了提高研磨效果,可加入一定量的石英砂(45~50目),但要注意其对目的蛋白的吸附作用。此法较温和,适宜实验室应用。大规模生产时,可用电动研磨法。

(1)研钵 研钵多用于研磨细菌或其他坚硬植物材料,研磨时常加入少量石英砂、玻璃粉或其他研磨剂,以提高研磨效果。加入石英砂时,要注意其对目的蛋白的吸收。

(2)细菌磨 细菌磨是一种改良的研磨器,比研钵具有更大的研磨面积,而且底部有出口。操作时先把细菌和研磨粉调成糊状,每次加入一小勺,研磨20~30s即可将细菌细胞完全磨碎。

(3)匀浆器 利用匀浆器产生的剪切力破碎组织细胞,先将剪碎的组织置于管中,再套入研杆来回研磨,上下移动,即可将细胞研碎。此法细胞的破碎程度比高速组织捣碎机高,对酶活力的影响也不大,适用于破碎量少和动物脏器组织。

王大虎 2.组织捣碎法

组织捣碎法是利用捣碎机的高速旋转叶片所产生的剪切力破碎组织细胞,是一种较剧烈的破碎细胞方法,适用于肌肉等较坚韧的组织及植物种子、叶芽等比较脆嫩的组织。通常先用家用食品加工机将组织打碎,然后再用10000~20000r/min的内刀式组织捣碎机(即高速分散器)将组织的细胞打碎。在捣碎期间必须保持低温,以防止温度升高引起目的蛋白变性,因此捣碎的时间不宜太长。

王大虎  (二)物理破碎法

物理破碎法是通过各种物理因素(如温度、压力、声波等)的作用,使组织细胞破碎。此法多用于微生物细胞的破碎。

1.反复冻溶法

将待破碎的细胞在-20℃以下冰冻,室温融解,反复多次进行,由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀,使细胞结构破碎。此法适用于细胞壁较脆弱易破的微生物菌体,但会存在破碎率较低的问题。

2.急热骤冷法

将材料投入沸水中,维持85~90min,再置水浴中急速冷却。此法适用于细菌及病毒材料。

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