王大虎

王大虎:压力差破碎法

压力差破碎法即通过压力的突然变化使细胞破碎的方法,常用的有高压冲击法、突然降压法、渗透压变化法等。高压冲击法是在结实的容器中装入细胞和冰晶、石英砂等混合物,然后用X或冲击锤施以高压冲击,冲击力可达50~500MPa,使细胞破碎。突然降压法是将细胞悬浮液装入高压容器,加压到30MPa甚至更高,打开出口阀门,使细胞悬浮液迅速流出,出口处的压力突然降低到常压,细胞迅速X而破碎。渗透压变化法是利用渗透压的变化使细胞破碎,即将待破碎的细胞先置于高渗溶液中平衡一段时间,再转入4℃左右的水中或其他低渗溶液中,因细胞内外的渗透压变化而使细胞破碎。

王大虎   4.超声波处理

超声波处理即利用超声波发生器所发出的声波或超声波作用,使细胞膜产生空穴作用而破碎细胞,可利用15~25kHz频率的超声波进行细胞破碎。该法在处理少量样品时,具有操作简便、效率高、液量损失少等特点,适于实验室使用,但不适于大规模的细胞破碎。若在细胞悬浮液中加入石英砂可破碎缩短时间。常采用间歇处理和降低温度的方法进行破碎,以防止电器长时间运转产生过多的热量导致目的蛋白失活和变性。

(三)化学破碎法

化学破碎法是通过各种化学试剂对细胞膜的作用使细胞破碎的方法。如有机溶剂(甲苯、丙酮、氯仿等)可以破坏细胞膜的磷脂双分子层,从而改变细胞膜的通透性,使胞内物质释放到胞外。而表面活性剂(曲拉通、吐温等)可和细胞膜中的磷脂及脂蛋白相互作用,破坏细胞膜结构,从而增加细胞膜的通透性。

王大虎   (四)酶促破碎法

1.自溶法

自溶法是在一定pH和适当的温度下,利用组织细胞内自身的酶系统将细胞破碎的方法。此过程需较长时间,常用少量防腐剂如甲苯、氯仿等防止细胞的污染。值得注意的是,此法酶系统中的有些酶也可能将目的蛋白降解。

2.酶溶法

酶溶法是根据细胞外层结构的特点,外加适当的酶(如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶、半纤维素酶、脂酶等)将细胞壁分解,使细胞内含物释放出来。有些细菌对溶菌酶不敏感,加入少量巯基试剂或8mol/L尿素处理后,使细菌变为对溶菌酶敏感而溶解。

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王大虎   三、细胞器的分离

 

制备某种生物大分子时,往往需要采用细胞中某一部分为材料;或者为了纯化某一特定细胞器上的生物大分子,通常破碎细胞后,先分离各组分,以防干扰,这对制备一些高难度和高纯度的生物大分子是必要的。细胞器的分离一般采用差速离心法和密度梯度离心法。

(一)差速离心

差速离心是在密度均一的介质中,由低速到高速逐级离心,使各种沉降系数不同的颗粒先后沉淀下来,达到分离目的的分离方法,如图2-1所示。此法适用于分离大小、形状相差较大的组分,即沉降系数差别在一个或几个数量级的颗粒。此法较简单,离心时,根据不同样品,选择好转速和时间,待沉降系数大的组分沉淀下来后,让上清液再在更高的转速下离心以沉淀沉降系数小的颗粒。

 

图2-1 差速离心分离

在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为:细胞核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高尔基体,最后为X白体。由于各种细胞器在大小和密度上相互重叠,而且某些慢沉降颗粒常常被快沉降颗粒裹到沉淀块中,一般重复2~3次效果会好一些。差速离心只用于分离密度和大小悬殊的细胞,更多用于分离细胞器。对于精细的分离,则是密度梯度离心效果更好。

(二)密度梯度离心

密度梯度离心是指用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度,将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部,通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。此法具有分辨力好、抗对流强、样品稳定等优点,如图2-2所示。

 

图2-2 密度梯度离心

根据原理的不同,密度梯度离心可分为速度区带离心和等密度离心。

1.速度区带离心

速度区带离心是把样品铺放在一个连续的或不连续的液体密度梯度中,用此梯度液作为颗粒沉降的介质。颗粒的沉降速度取决于其大小、形状、密度,也取决于离心力以及介质的密度和黏度,所以沉降系数相差为20%或差别更小的颗粒可以用这一方法毫不困难地分离。可以说,速度区带离心法在一次离心过程中实现了几次多级差速离心的过程,扩大了差速离心法的分离范围。

对于形成梯度的材料,其要求是:所形成的溶液密度应包括所需要的密度范围(样品溶液的密度应比梯度顶端的密度小,样品颗粒的密度应比梯度底端的密度小);所形成的溶液的黏度要低,对离子强度及pH所产生的影响应最小;对生物样品应具有惰性,即不会发生化学反应;在溶液中无水合作用,无表面活性,不与质点发生化学作用,不影响光学监测数据的测定;离心后易分离除去,不妨碍分析等。经常使用的梯度材料有蔗糖、甘油及盐类(如氯化铯、氯化铷)等。

进行速度区带离心时,温度要控制好,一般以不使样品失活为宜。另外,样品的温度与梯度的温度要相同,否则由于温度差会引起对流而使样品扩散。同时,样品溶液、梯度溶液的温度与离心时的温度也要相同,通常采取冷冻离心机。离心时所选用的时间及速度极为重要,不要使用过长的时间或过高的转速,以免样品失活。

速度区带离心主要用于分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。它可以分离从细胞到各种大分子颗粒的组分,因此,分离制备所需要的离心条件也极不一样。

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