王大虎

王大虎:等密度离心

等密度离心与分离颗粒的大小无关,而与它们的密度有关,它是一种测定生物物质颗粒的浮力密度的静力学方法。离心开始前,把样品加在密度梯度溶液的上层或均匀分布在梯度溶液中,梯度可预先制备或让其在离心时自然形成。离心后,离心管底部的密度大于生物物质的密度,而上部的密度则小于它,生物物质向着离心管内部梯度中相当于其本身浮力密度的某个位置移动,最终达到与自己密度相同的液体层次处,再离心也不再有密度的变化(这也是等密度离心与速度区带离心的区别之一),每种生物物质形成一条狭窄的带。

等密度离心中,经常使用的梯度材料是氯化铯,因为氯化铯溶液在离心力场(通常为超速离心力)作用下能形成一连续的密度梯度。实际上,通常所指的等密度离心就是指氯化铯密度梯度离心。

王大虎   (三)过滤

在经过离心操作后,样品一般还需过滤才能进入下一个阶段,过滤是为了除去蛋白质样品溶液中细小的颗粒。在实验室内,通常先用滤纸过滤,再进行膜过滤,一般选用孔径为0.2µm和0.45µm的塑料膜。过滤操作可以在常压或减压状态下进行。

膜过滤可以除去细胞和细胞碎片,分离效率高,流速高,所需时间短,处理量大,设备可靠,简单。膜的材料有聚丙烯、醋酸纤维和硝酸纤维等。对于几毫升的少量样品,可以选用Gelman Laboratory的0.45µm注射型膜过滤器,非常方便。

大虎说事
大虎说事

王大虎   影响膜过滤的因素主要有:压力差、颗粒浓度和操作温度。膜两侧的压力差最好保持在较小且可以提供足够的驱动力水平,以保证流量在合适的范围内,压力差增加,流量也增加。但是超过一定的压力差,流量就不会增加了,过高的压力差反而会降低流量。进料中固体浓度增加会导致流量的下降。升高操作温度可以降低溶液的黏度,从而提高流量,但是从蛋白质纯化的总体来考虑,还是在低温(4℃)下进行膜过滤比较合适。

为了能够重复使用膜或在长时间操作过程中保证高的流量,需要定时清洗膜,具体有物理方法、化学方法、生物方法等。物理方法有水洗、反冲、超声波处理等,无机膜可以用热处理。许多化学试剂可以用于清洗膜,如0.1mol/L NaOH溶液、1~2mol/L NaCl溶液、0.1mol/L HCl溶液、0.25%~0.3%HNO3溶液或1%胰蛋白酶溶液等。需要注意膜生产厂家对清洗试剂的要求。

 

 

王大虎   四、蛋白质提取时的保护性措施

 

影响蛋白质水解变性的因素有外在因素和内在因素两方面,外在影响因素主要包括细胞破碎方式、缓冲液pH、温度、离子强度、还原剂和金属离子等;而内在影响因素主要是蛋白水解酶的问题,提取过程中要注意采取一定的保护措施。

一般理想的提取溶液应具备下述条件:对有效成分溶解度大,破坏作用小;对杂质不溶解或者溶解度很小;来源广泛、价格低廉、操作安全等。以下是提取有效成分的影响因素及相应的保护性措施。

(一)外在影响因素及预防措施

1.细胞破碎方式

破碎组织有多种方法,但应选择那种能使所需蛋白质获得高产率而又无明显变性的方法。机械组织匀浆器或搅切器对于破碎组织和制备组织匀浆是极有用的,这些机器的主要不足是有可能产生泡沫。当水溶液中的蛋白质在空气与水界面处形成薄膜时会产生气泡和泡沫,在这些界面形成的表面上蛋白质可能会变性,因此要避免起泡沫以得到有活性的蛋白质。此外,细胞破碎后,要降低温度,尽快萃取,避免氧化、吸附和污染。

2.缓冲液的pH

如第一章所述,提取缓冲液的pH是一个关键性参数,应一开始就确定最适pH。酸性蛋白如钙调蛋白,在pH高于中性的条件下很容易溶解;碱性蛋白在酸性pH条件下较易溶解;具有中性等电点(pI)的蛋白质在高于或低于pI的pH条件下很容易溶解。一般说来,提取蛋白质时应在远离其pI的pH条件下进行,以不危及蛋白质的化学属性。避开极端pH条件是个好主意,因为在此种条件下有可能发生蛋白质结构的化学变化。当缓冲液pH达到9.0以上时,可能发生谷氨酰胺和天冬酰胺侧链的脱酰胺作用,结果使蛋白质含有不正常数目的谷氨酸和天冬氨酸残基,从而改变其pI。高pH条件下,肽键也会发生部分水解,某些修饰组分也会降解。在温和的酸性(pH4.0~6.0)条件下,蛋白质在化学上是相当稳定的。不过,极低的pH条件会使某些蛋白质变性和沉淀,导致生物活性的丧失。

选择缓冲液时,首要考虑的是能覆盖所需pH的有效缓冲范围。除缓冲液外,从组织提取出来的蛋白质及其他离子、分子等也可能极大地改变溶液的pH。因此,应在其有效缓冲范围的中点处使用缓冲液。另外,进行组织提取时的一个问题是缓冲容量,它与用于组织提取溶液的体积密切相关,如用小体积提取,从组织提取的蛋白质及其他分子的浓度就高,这时要求用较高浓度的缓冲液。在许多情况下,可方便地使用较大的体积,这时用稀的缓冲液就足够了。最后,化学相容性是选择缓冲液的又一考虑。如果氨基会干扰下一步操作如阳离子交换层析的话,含有伯胺的缓冲液就不合适了。类似地,磷酸缓冲液会干扰下一步的阴离子交换层析。

除此之外,有些提取过程中的最适pH与有效成分活性稳定的pH并不一致,这一点要特别注意。

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