王大虎

王大虎:固态保存

蛋白质提取液在干燥状态下比在溶液状态稳定。一般蛋白质含水量超过10%时,无论在室温或低温下均容易失活;含水量若降低至5%时,在室温或冰箱中均比较稳定,但在37℃时活性则明显下降。长期保存蛋白质的最好办法是把它们制成结晶或干粉。

王大虎    第二节 具体提取策略

一、动物组织中蛋白质的提取

动物材料中的蛋白质有些是以可溶的形式存在于X(如血浆)中,这些蛋白质可以不必经过提取直接进行分离;而有些像角蛋白、胶原蛋白等一些不溶性蛋白,必须先除去一些与实验无关的结缔组织、脂肪组织,再用适当的方法提取后才能加以分离,这是动物蛋白质与其他来源蛋白质在提取方式上的主要区别。

在对动物组织中的蛋白质等生物大分子或细胞器进行分离时,首先要进行的是粗提液的制备。组织的破碎是目标物得以提取的关键。严谨而规范的实验操作技术可以获得高产量、无污染、有活性的生物大分子或细胞器。应用均质技术,可使大量细胞表面的质膜破裂,从而释放细胞溶质,但又不会对细胞亚结构、细胞器等造成广泛损害。由于动物细胞仅仅由质膜所包裹,所以从动物组织中提取生物大分子相对简单一些。与许多细菌和植物细胞相比,动物细胞相当脆弱,因此对剪切力较敏感。动物组织可被粗略地分为软组织(如肝,肾)和硬组织(如骨骼和心脏),一般可以产生液体剪切力的机械力量就可以破坏软组织,而硬组织则需要由搅拌机和碎肉机等产生的强有力的剪切力才能破坏。

王大虎   (一)动物组织的选择

根据所需提取的目标大分子的不同,选择不同的动物组织。众多因素决定了如何初步选择以纯化为目的的蛋白质组织。首先,理想的组织必须具有丰富的蛋白质含量。举例来说,肾皮质上的一些细胞表面肽酶表达水平高,器官本身相对较大,常常可以从中分离出大量的目的蛋白。

第二个必须考虑的因素是动物组织的可获得性。大型家畜(特别是猪和牛)的组织可以从各地的屠宰场获得,而小动物(如小鼠、大鼠和家兔)的组织可以从一些动物机构或者X获得。很显然,小鼠的组织适宜用来纯化少量的某种蛋白质,而猪的肝脏则适合大量提取。

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另外,还有一些需要考虑的因素,如组织的新鲜度和组织破碎的难易程度。对某些蛋白质来说,使用新鲜的组织是相当重要的,而这一要求同时也会影响到对组织来源的要求和提取策略。

所以,理想的原料组织的选择依据应该是组织容易获得、目标物含量高、制备工艺简单、成本低、重现性好等。材料选定后要尽快提取以保持新鲜,若暂不提取,需冷冻保藏。在处理动物组织时,应严格遵循实验室规则。

王大虎  (二)动物组织的破碎

动物组织破碎的目的是在能保持细胞活力的低温条件下,用快速的机械或超声波等方式使细胞膜破裂,让细胞内亚细胞组分逸出。常用的工具有组织捣碎器、玻璃匀浆器、超声波细胞破碎仪等。应根据不同组织细胞的特点选用不同的工具。用于破碎动物组织细胞的方法主要有机械法、超声波破碎法、高压匀浆法和溶胀法。

组织的破碎方法取决于目标物位于胞内还是胞外,目标物的可溶性还是膜结合的等。对于大型器官如猪肾脏、X等,可先用剪刀将其剪成碎片,再采用绞切器快速破碎;对于硬组织,如骨骼肌、心肌、肺等,因含较多纤维而不能直接用搅切器搅拌,需先用带有旋转叶片的碎肉器粉碎,再进行匀浆;对于软组织,如肝脏、肾脏、脑等,可采用玻璃-玻璃或玻璃-四氟乙烯均质器进行均质。如果所得物软组织含量较少,可采用简便的手提式组织均质器,使一些主要的细胞器得到释放,如细胞核、溶酶体、过氧化物酶体和线粒体,若均质的条件足够严格,内质网和高尔基体也得到释放;如果所得物软组织含量较多,则直接置于搅切器中快速破碎。组织搅切后得到的组织糜,直接加入一定比例[组织糜(g)∶缓冲液(mL)=1∶1]的缓冲液,然后通过细纱布除去悬浮的脂肪和一些大块组织等。若提取的目标物是蛋白质,根据蛋白质的不同,均质缓冲液中可能需要加入蛋白酶抑制剂。均质后,残留的大块组织可通过细纱布或者低速离心除去。均质过程应在4℃下进行,均质化时间应尽量短,以减少不必要的蛋白质水解和变性。

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