王大虎

王大虎:真菌中蛋白质的提取

真菌是一类种类繁多、结构多样的生物,从单细胞的酵母菌到高度分化的直径大于1m的大型真菌。真菌中含有大量的蛋白质,其中蘑菇中蛋白质含量占到其干重的31%。因此真菌蛋白质的提取,其来源比较广泛。而且真菌中的一些酶和人类的生活密切相关,例如酿酒酵母应用于酿酒发酵行业,一些霉菌在制作酱油的过程中被大量使用。

王大虎 (一)真菌蛋白质提取的影响因素

针对真菌细胞的生长特点,提取真菌细胞蛋白质时需要考虑以下因素:

(1)真菌的生长周期 微生物都有其固有的生长周期,不管是单细胞的酵母菌还是丝状真菌,它们都经历生长、分化、衰老、自溶的不同时期。因此,不同的蛋白质和不同的真菌生长周期相关联。所以在提取真菌中蛋白质的时候,要充分考虑到其是在哪一个时期合成的,利用菌体的这个生长特点合成最多的目标蛋白质,进而进行蛋白质提取。

(2)酶合成的特点 很多酶在细胞生长周期中合成的时候是顺序合成的,即可能在某一些特定压力或周围环境的变化下而合成,或是因某些底物或某些化合物的诱导而合成。例如,甲壳素诱导合成甲壳素酶,葡萄糖能诱导合成某些蛋白水解酶。

(3)真菌细胞的细胞壁和细胞膜结构 确定提取的目的蛋白是定位在细胞膜上、细胞质中、还是分泌到细胞外的蛋白质或酶,就是一件十分重要的工作。因为细胞膜上的蛋白质和分泌到细胞外的蛋白质会因为提取的目标是细胞质中的蛋白质而丢失。有些酶是被环境中的底物所诱导合成,然后分泌到培养基中,所以只要通过收集培养液并离心提取,就可以获得目的蛋白。

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王大虎 (二)真菌蛋白质提取程序

1.真菌蛋白质的培养和收获

(1)培养基的选择 培养基的选择因所选用的真菌而有所差异。一般来说真菌的液体培养基有麦芽汁培养基和马铃薯葡萄糖培养基、葡萄糖酵母培养基和丝状真菌培养基。一些组织生长可能需要更加丰富的养分,可以选用酵母膏蛋白胨培养基。

(2)培养时间的确定 培养的时间对于收获目的蛋白也十分关键。菌体一般首先在25℃下培养60h,然后接种培养(25℃,3~5d)。生长的温度要取决于不同菌体的生长和分化的情况。大部分酵母菌适宜在30℃下生长24h,然后转移到摇瓶生长24h。大部分的丝状真菌需要在初始培养基中培养60h,然后转移到摇瓶生长3~5d。

2.选用抑制剂

随着培养时间增加,真菌会分泌一些较强的蛋白酶。常添加的蛋白酶抑制剂包括EDTA、PMSF、抑肽素等。

3.选用合适的缓冲液

提取真菌蛋白质常用的缓冲液是Tris-甘氨酸缓冲液。有报道比较了不同的缓冲液对真菌蛋白质提取的影响,得出9mol/L尿素缓冲液有很好的复性作用。

4.测定生长周期

通常,目标蛋白质总是和真菌的活跃生长周期相关联。因此在收获之前有必要建立不同的生长周期曲线。酵母和与酵母类似的丝状真菌的生长周期可以通过测定培养基的浊度来建立其生长周期。另外一个方法是测定葡萄糖苷酶(glucosidase)、半乳糖苷酶(galactosidase)、双乙酰-几丁质酶(diaсеtyl-chitobiosidase)等三种酶的酶活力。在葡萄糖培养基培养的很多真菌中,这三种酶是和特定的生长周期相联系的。葡萄糖苷酶一般是产生在早期;半乳糖苷酶要到葡萄糖浓度下降到一定浓度才会产生;双乙酰-几丁质酶直到要自溶的时候才会产生。

王大虎  5.收获

当特定的生长周期到达时,从生长培养基中收获菌体。不同的真菌采用不同的收获方法。一般来说,酵母菌在3000~8000r/min下离心,丝状真菌一般用真空浓缩的方法。如果是胞外蛋白,直接从收获菌体的培养基中提取得到,然后利用离子交换或凝胶过滤的方式得到目的蛋白或是除去杂蛋白质。

6.细胞破碎

针对不同的菌种,细胞破碎选用不同的方法,有物理法、化X和酶法等。用一些酶来消化细胞壁,产生原生质体,然后再释放胞内的蛋白质。很多真菌中的蛋白酶在酶法去除细胞壁的时候是存在活力的,对目的蛋白可能有较大的破坏作用。物理方法中的冻融是个比较好的选择。酵母菌细胞比较脆弱,在较小的压力下会破碎。经常使用的方法就是在冰冻的细胞悬液中加入玻璃珠中摇晃,以破碎细胞。高分子质量的蛋白质有可能因为细胞的反复冻融而产生破坏作用,建议分装在不同的离心管中,加入Tris-甘氨酸缓冲液,并适当加入尿素、EDTA保护。

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