王大虎

王大虎:植物组织亚细胞中蛋白质的提取

植物细胞除了含有与动物细胞一样的细胞器,如细胞核、线粒体、核糖体、内质网外,还有动物细胞没有的叶绿体。因此,也和动物细胞一样,如果要分离制备分布在这些细胞器中的蛋白质,为了防止其他细胞组分中的物质对目的蛋白的干扰或污染,还需先将细胞器分离出来,然后再在某一细胞器中分离某一蛋白质。

王大虎  (一)植物组织亚细胞的破碎

常用于破碎植物组织亚细胞的方法类似于动物组织亚细胞,主要有:机械法、超声波破碎、高压匀浆、溶胀法。具体原理和操作见上节所述。

(二)匀浆介质的选择

植物组织亚细胞的匀浆介质的选择策略类似于动物组织亚细胞的匀浆介质的选择。可以参考上节所述内容。

(三)离心

植物组织亚细胞组分经破碎释放出后,常依据其不同的沉降系数和在匀浆介质中的密度,用离心技术来加以分离。离心方法可以分为差速离心和密度梯度离心等。

王大虎 (四)应用实例:马铃薯亚细胞结构线粒体的提取

王大虎
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(1)材料 马铃薯块茎

(2)试剂

①A液:0.3mol/L蔗糖、50mmol/L Tris-HCl(pH7.0)、3mmol/L EDTA、0.1% BSA、10mmol/L β-巯基乙醇、1.0% PVP、10mmol/L MgCl2、0.1%抗坏血酸;

②B液:0.3mol/L蔗糖、50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)、20mmol/L EDTA、0.1% BSA;

③C液:0.3mol/L蔗糖、50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)、10mmol/L MgCl2;

④TE:50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)、20mmol/L EDTA。

(3)仪器 组织捣碎机、离心机、针头。

王大虎 (4)提取步骤

①称取马铃薯块茎材料200g,加入预冷的2.5倍体积的匀浆A液。

②组织捣碎机中匀浆,4层纱布过滤,滤液于4000r/min离心10min,收集上清液。

③上清液于14000r/min离心15min收集沉淀,用A液悬浮沉淀加入MgCl2使其浓度到15mmol/L。加入50µg/mL DNA酶Ⅰ于冰浴上反应30min。

④反应完后加入EDTA,至浓度20mmol/mL,终止反应。加入约2倍体积A液,于14000r/min离心15min,用B液重悬浮线粒体沉淀。

⑤蔗糖过垫梯度纯化:在35mL离心管中自下而上按顺序铺55%、48%、38%、三层糖垫。梯度顶端加5mL线粒体重悬浮液,于26500r/min离心90min。用弯针头小心地将位于离心管内中部的线粒体条带吸出。

⑥用2倍体积A液洗涤,加入MgCl2到15mmol/L,搅匀,于14000r/min离心15min,少量C液悬浮沉淀,即提取出马铃薯亚细胞结构线粒体。

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