王大虎

王大虎:富含多酚化合物的植物组织中酶的提取

当需要提取的酶存在于富含酚及酚类化合物的植物绿叶、水果和蔬菜组织时,必须除去酚及酚类化合物,否则会影响后面的提取分离工作。酚类化合物在完整的组织和细胞中是不被氧化的,但是当组织破损时,酚类化合物在PPO、单酚氧化酶或过氧化物酶的催化下迅速氧化成褐色的醌类物质和水,醌类又会在酪氨酸酶等的作用下与组织中的蛋白质发生聚合,进一步引起其他酶系统失活。因此,为提取酶将植物组织研磨时,都在有吸附酚类化合物(无论单体或化合物)的吸附剂或氧化酶的抑制剂或抗氧化剂存在下进行,通过抑制氧化反应,防止产生醌类化合物。

王大虎  (一)酚类化合物的吸附剂

酚类化合物吸附剂有可溶性的,如单宁酸结合蛋白质和PVP;也有不溶性的,如交联聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)等,这类吸附剂很容易从组织提取液中除去。此外,还有不带电荷的聚苯乙烯和聚丙烯酸树脂,如疏水作用树脂(XAD-2,XAD-4,XAD-7)、聚苯乙烯为基质的离子交换树脂、阴离子交换树脂(Bio-Rad AG1-X8,Bio-Rad AG2-X8,Bio-Rad Dowex-1)和阳离子交换树脂(Dowex-50)等。因不同的酚类化合物对这些吸附剂有不同的亲和力,所以在实际应用中应根据实际情况选择不同的吸附剂。

(二)氧化酶的抑制剂或抗氧化剂

加入氧化酶的抑制剂或抗氧化剂可以抑制酚类化合物的氧化反应。通常会加入金属螯合剂、抗坏血酸、亚X氢盐以及可作为奎宁还原剂的β-巯基乙醇。这些化合物在提取液中往往不只产生一种作用,如β-巯基乙醇,既可抑制氧化酶的活性又可减少醌的含量;Dieca(一种金属螯合剂)可抑制氧化酶的活性,并能和醌发生反应;PVP可作为酚类化合物的吸附剂且能抑制氧化酶的活性。

王大虎  (三)应用实例:富含酚及酚类化合物的植物叶中核酮糖二磷酸羧化酶的提取

王大虎
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(1)材料 植物叶。

(2)试剂

①提取液:100mmol/L Hepes/NaOH、10mmol/L NaHCO3、10mmol/L MgCl2、0.1mmol/L EDTA、10mmol/L β-巯基乙醇、10mmol/L乙硫氮钠、0.1%吐温80,调pH为7.0,再加入NaHCO3和乙硫氮钠,用之前加入β-巯基乙醇;

②适量PVPP;

③饱和X铵:20g/100mL、35%;

④35%~55%的饱和溶液:20mmol/L Tris-HCl(pH7.0)、10mmol/L DTT。

(3)仪器 搅拌器、离心机。

(4)提取步骤

①取100g叶物质,切成片状,浸入500mL预冷的提取液中,搅拌。

②加入不可溶的PVPP(于250mL提取液过夜平衡),然后转移提取物到一个烧杯中,加入饱和X铵同时连续搅拌直到全部溶解。

③将提取液转移到离心管中,静置30min,弃沉淀(PVPP和无活力蛋白)。

④用8层纱布过滤,用12g/100mLX铵处理。静置30min,于25000r/min离心15min。

⑤在35%~55%的饱和溶液25mL中沉淀蛋白,用加入3g的PVPP(经悬浮缓冲液过夜平衡)处理3次。

⑥静置10min(偶尔搅拌),于10000r/min离心悬浮液30min,用50µm尼龙薄网过滤,取上清液。

⑦提取液可用于下一步的核酮糖二磷酸羧化酶的纯化。

王大虎 (5)提取过程的注意事项

①酶提取普遍最优pH为7.0和6.5。原因是提取液的pH会影响酚类物质与蛋白质和吸附剂的相互作用。酚醛基团在碱性条件下电离,就不会与蛋白质和PVPP形成氢键,碱性条件(pH>7.5)会促进二羟基酚自动氧化为醌,同时巯基保护试剂也会自动氧化。

②所有操作尽量在5℃下进行。溶液要预冷过夜。操作要尽快,尽量减少酚类化合物在空气中的暴露。

③提取液的用量一般是原材料的5~7倍。确保破碎的细胞被淹没,释放出的苯酚和氧化酶得到稀释,保证充足的苯酚吸附剂及氧化酶抑制剂用量。提取液的体积必须保证搅拌器刀片的速度可充分地切碎细胞的同时不会有暴露在空气中的组分。

 

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