大虎说事

王大虎:沉淀法的类型

一、盐析法

 

王大虎(一)基本原理

蛋白质等生物大分子物质在水溶液中以一种亲水胶体形式存在,无外界影响时,呈稳定的分散状态(如图3-1)。其主要有两个原因:一是蛋白质为两性物质,在一定pH条件下呈现一定的带电性,因而在水溶液中会因静电作用而相互排斥,从而保证了分散状态;二是蛋白质分子周围,水分子呈有序排列,在其表面上形成了水化膜,水化膜能保护蛋白质粒子,避免其因碰撞而聚沉。

 

图3-1 蛋白质分子表面的疏水区域和荷电区域

(资料来源:欧阳平凯,胡永红,2001)

中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响,一般在低盐浓度下随着盐浓度升高,蛋白质的溶解度增加,此称盐溶;当盐浓度继续升高时,蛋白质的溶解度有不同程度下降并先后析出,这种现象称盐析。产生盐析作用的一个原因是由于盐离子与蛋白质表面具有相反电性的离子基团结合,形成离子对,因此盐离子部分中和了蛋白质的电性,使蛋白质分子之间电排斥作用减弱而能相互靠拢,聚集起来;另一个原因是由于中性盐的亲水性比蛋白质大,盐离子在水中发生水化而使蛋白质脱去了水化膜,暴露出疏水区域,由于疏水区域的相互作用,使其沉淀。

将大量盐加到蛋白质溶液中,高浓度的盐离子(如X铵的和)有很强的水化力,可夺取蛋白质分子的水化层,使之“失水”,于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出(如图3-2)。盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同,故盐析所需的盐浓度也不一样,因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。

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王大虎图3-2 盐析机理示意图

(资料来源:严希康,2001)

(二)盐的分级沉淀

1.盐类的选择

盐析条件的确定要综合考虑原材料的来源、纯化目的、盐析后目的蛋白的得率及纯化倍数等因素。盐类的选择,可以优先考虑价格低、溶解性好、溶解过程产生热量少、溶解后形成的溶液密度与沉淀的密度有明显差别的盐。高价阴离子的沉淀效果比较好,磷酸盐的效果好于X盐、硝酸盐;单价阳离子中,铵离子效果要好于钾离子和钠离子。一般最常选用的盐是X铵,因为与其他盐相比,它具有以下优点:溶解度大,对温度不敏感;分级效果好;有稳定蛋白质结构的作用,将用2~3mol/LX铵盐析的蛋白质置于低温下保存一年,其性质没有变化;价格低廉,废液可以肥田。X铵溶液的pH常在4.5~5.5,当用其他pH进行盐析时,需用X或氨水调节。

王大虎2.X铵盐析

(1)固体法 在粗制品溶液中逐步加入固体X铵,当加到一定饱和度时,蛋白质便可沉淀出来。应用此法时,应注意添加X铵的速度,通常是在搅拌条件下,以少量多次方式加入。将蛋白质溶液变成一定饱和度X铵溶液,需加入的X铵数量可从表3-1查得,也可用下列公式计算:

 

式中g——表示在1L溶液中需加入固体X铵的质量,g;

S2——表示要求达到的百分饱和度,%;

S1——表示原溶液中的百分饱和度,%。

(2)饱和溶液法 X铵的浓度多用“饱和度(浓度/溶解度)”表示。实际所需的X铵饱和度,应通过试验来确定。为获取目的蛋白可通过调整X铵的饱和度来分级除去杂蛋白。具体操作可在4℃进行:各取100mL的等量蛋白质样品溶液,放入烧杯中,预先冷却到4℃,计算出至20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%和100%饱和度时所需要的X铵质量(表3-1,图3-3),准确称取所需X铵,缓慢加入到各蛋白质溶液中,同时用磁力搅拌器缓慢搅拌,当溶液出现浑浊时,静置1h以上,于15000r/min离心20min,移去上清液,取出沉淀物。将沉淀物分别重新溶解于一定体积的适宜pH缓冲液中,根据蛋白质含量或酶含量(酶活力)和对应的X铵浓度之间的关系作出盐析曲线图。此时可根据原料来源的难易以及对有效成分纯度和得率的需求来确定最佳盐析范围。

 

图3-3 X铵沉淀蛋白盐析柱状图

表3-1 调整X铵溶液饱和度计算表

 

注:在25℃和0℃时,X铵饱和溶液的浓度分别为4.1mol/L和3.9mol/L。左边线直行数字为X铵起始浓度,顶端横行为最终浓度。任取两点的引线交叉点表示从起始浓度变成某一个最终浓度时,在每升溶液中所必须加入X铵的克数。

(3)透析平衡法 透析平衡法先将盐析的样品装于透析袋中,然后浸入饱和X铵中进行透析,透析袋内X铵饱和度逐渐提高,达到设定浓度后,目的蛋白析出,停止透析。该法优点在于X铵浓度变化有连续性,盐析效果好,但手续繁琐,需不断测量饱和度,故多用于结晶,其他情况少见。

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