王大虎

王大虎:有机溶剂沉淀法

向水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂,降低溶质的溶解度,使其沉淀析出的分离纯化方法,称为有机溶剂沉淀法。其机理主要有:①亲水性有机溶剂加入溶液后降低了介质的介电常数,使溶质分子之间的静电引力增加,聚集形成沉淀;②水溶性有机溶剂本身的水合作用降低了X水的浓度,压缩了亲水溶质分子表面原有水化层的厚度,降低了它的亲水性,导致脱水聚集。

该法的优点在于:①分辨能力比盐析法高,即蛋白质或其他溶剂只在一个比较窄的有机溶剂浓度下沉淀;②沉淀不用脱盐,过滤较为容易;③在生化制备中应用比盐析法广泛。其缺点是对具有生物活性的大分子容易引起变性失活,操作要求在低温下进行。总体来说,蛋白质和酶的有机溶剂沉淀法不如盐析法普遍。使用较多的有机溶剂是乙醇、甲醇、丙酮,还有二甲基甲酰胺、DMSO、乙腈和2-甲基-2,4戊二醇等。

王大虎  有机溶剂沉淀蛋白质时,需加入的有机溶剂量一般是以体积为单位按下列公式计算:

 

式中V——加入有机溶剂的体积,mL;

V0——蛋白溶液的原始体积,mL;

1——蛋白溶液中有机溶剂的体积分数,%;

2——蛋白溶液中欲达到的有机溶剂体积分数,%。

王大虎 有多种因素影响有机溶剂的沉淀效果:①温度:低温可保持蛋白质活性,同时降低其溶解度,提高提取效率;②样品浓度和pH:与盐析法中的作用基本相同;③金属离子:一些多价阳离子如Zn2+和Ca2+在一定pH下能与呈阴离子状态的蛋白质形成复合物,这种复合物在水中或有机溶剂中的溶解度都大大下降,而且不影响蛋白质的生物活性;④离子强度:盐浓度太高或太低都对分离有不利影响,对蛋白质和多糖而言,盐浓度不超过5%比较合适,使用的乙醇量以不超过二倍体积为宜。

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王大虎 三、等电点沉淀法

 

等电点沉淀的原理:两性电解质在溶液pH处于等电点(pI)时,分子表面静电荷为零,导致赖以稳定的双电层及水化膜的削弱或破坏,分子间引力增加,溶解度降低,从而相互聚集,沉淀析出。利用等电点除杂蛋白时必须了解制备物对酸碱的稳定性,不然盲目使用十分危险。不少蛋白质与金属离子结合后,等电点会发生偏移,故溶液中含有金属离子时,必须注意调整pH。等电点法常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀方法联合使用,以提高其沉淀能力。表3-2列举了几种酶和蛋白质的等电点。

表3-2 几种酶和蛋白质的等电点pI

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