王大虎

王大虎:亲和沉淀法

将亲和试剂加入到含有靶蛋白的混合溶液中,就可以形成亲和配体-靶蛋白的共聚物。这种共聚物可以在一定条件下形成沉淀,通过过滤或离心的方式进行分离,然后将酶或蛋白质从亲和配体-聚合物上解离下来。这一过程类似于蛋白质的亲和层析,因此将这种分离提纯蛋白质的技术称为亲和沉淀。以脱乙酰几丁质作为例,可以说明亲和沉淀法分离蛋白质的基本原理与过程(图3-5)。

图3-5 用脱乙酰几丁质亲和沉淀法分离蛋白质原理示意图

(资料来源:庄蕾,陈冠军等,1998)

这种利用亲和沉淀分离蛋白质的方法同传统的蛋白质分离技术相比,可以显示出亲和沉淀的优越性:①它可以直接处理包含有细胞壁碎片的黏滞溶液,加入亲和性聚合物形成可溶性亲和配体复合物后,通过离心除去颗粒性物质,然后改变一定条件,使聚合物-靶蛋白共聚物发生沉淀。②亲和沉淀在分离靶蛋白的同时,可以将之浓缩成较小体积,减少了后续分离的工作量,节约了化学试剂,因而更经济有效。③可进行多级亲和沉淀,如果样品液中还包含其他有用的物质,可以使用另一种亲和沉淀剂或改变纯化策略加以分离提取。

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王大虎  五、其他沉淀法

(一)生成盐复合物沉淀法

蛋白质等生物大分子和小分子都可以生成盐类复合物沉淀,此法一般可分为3种:与生物分子的酸性功能基团作用(如铜盐、银盐、锌盐、钙盐等);与生物分子的碱性基团作用(如苦味酸盐、苦酮酸盐、单宁酸盐等);无机复合盐法。

1.金属复合盐法

许多有机物质包括蛋白质在内,在碱性溶液中带负电荷,能与金属离子形成沉淀。根据有机物与它们之间的作用机制,可分为羧酸、胺及杂环等含氮化合物类,参与反应的金属离子如铜、锌、镉;亲羧酸而对含氮配基没有亲和力类,参与反应的金属离子如钙、镁、铅;亲硫氢基化合物类,参与反应的金属离子如汞、银、铅。蛋白质-金属离子复合物的重要性质是它们的溶解度对溶液的介电常数非常敏感,调整水溶液的介电常数(如加入有机溶剂),即可沉淀多种蛋白质。所用金属离子浓度约为0.02mol/L左右即可。

王大虎 2.有机盐法

含氮有机酸如苦味酸、苦酮酸、鞣酸等能与有机分子的碱性功能团形成复合物而析出沉淀。但此法常发生不可逆的沉淀反应,故用于沉淀蛋白质时,需采用较温和的条件,有时还需加入一定的稳定剂。

(1)单宁 为多元酚类化合物,分子上有羧基和多个羟基,可与蛋白质分子形成氢键而结合在一起,从而形成巨大的复合颗粒沉淀下来。它沉淀蛋白质的能力与蛋白质种类、环境、pH及单宁本身的来源和浓度有关。单宁与蛋白质结合得较牢固,一般多采用竞争结合法,即选用比蛋白质更强的结合剂与单宁结合,使蛋白质游离释放出来。此类竞争型结合剂有乙烯氮戊环酮、PEG、山梨糖醇甘油酸酯等。

(2)三氯乙酸(TCA) 沉淀蛋白迅速而完全,一般会引起变性。但低温短时间作用可使一些较稳定的蛋白质或酶保持原有的活力。

王大虎 3.无机复合盐法

常用的无机复合盐有磷钨酸盐、磷钼酸盐等。磷钼酸盐可同时沉淀高、中分子质量的蛋白质。

无机复合盐溶解度很低,极易沉淀析出。若沉淀为金属复合盐,可通以H2S使金属变成硫化物而除去;若为有机酸盐或磷钨酸盐,则加入无机酸并用X萃取,把有机酸和磷钨酸等移入X中除去,或用离子交换法除去。值得注意的是此类方法常使蛋白质发生不可逆沉淀,应用时必须谨慎。

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