大虎说事

王大虎:蛋白质变性剂沉淀法

1.碱性蛋白质

碱性蛋白质属于离子型多聚物沉淀剂,它与蛋白质形成类似盐键而结合起来,是一类温和的沉淀剂。多价阳离子的碱性蛋白质,如鱼精蛋白,除能有效地沉淀核酸外,还能沉淀某些蛋白质(主要为酸性蛋白质)。当把90mg鱼精蛋白加入部分纯化的酵母磷酸果糖激酶溶液(含1g蛋白)中时,溶液中的酶蛋白便吸附到鱼精蛋白-核酸沉淀物上。沉淀物用0.1mol/L磷酸缓冲液洗脱后,收得的磷酸果糖激酶的纯度比原来提高了9倍。但是,多价阳离子碱性蛋白质移去阴离子物质的反应多半是不可逆的,导致它的应用受到了限制。另外在应用多价阳离子物质时,因其水溶液pH为2~3,所以要先中和后,再加到蛋白质溶液中。

2.凝集素

凝集素是自然界中广泛存在的一类能与糖类专一、可逆结合的非免疫来源的蛋白质或糖蛋白。凝集素沉淀蛋白质的原理为:它与样品中的糖蛋白的糖链特异结合并沉淀下来,通过离心即可将糖蛋白与其他蛋白质分开,获得的凝集素-糖蛋白复合物可用单糖作为洗脱剂使糖蛋白解离出来。如伴刀豆球蛋白可与含有葡萄糖、甘露糖等分子的糖蛋白发生特异性凝集沉淀。该方法具有反应条件较温和,转移性强的优点。

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王大虎 (三)选择性变性沉淀法

选择性变性沉淀的原理是利用各种蛋白质、酶等生物大分子对某些物理或化学因素如温度、酸碱度和有机溶剂等敏感性不同,有选择地使之变性沉淀,而欲分离的有效成分则存在于溶液中(或者发生可逆性沉淀),以达到分离纯化的目的。

此方法可分为:①利用表面活性剂(TCA)或有机溶剂引起变性;②利用对热的不稳定性,加热破坏某些组分,而保存另一些组分;③酸碱变性。

王大虎 (四)非离子多聚物沉淀法

非离子多聚物是20世纪60年代发展起来的一类重要沉淀剂,最早用于提纯免疫球蛋白,沉淀一些细菌和病毒,近年来逐渐广泛应用于蛋白质和酶的分离纯化。这类非离子多聚物包括不同分子质量的PEG、NPEO、葡聚糖、右旋糖酐X钠等,其中应用最多的是PEG。这种沉淀的条件温和,不易引起蛋白质变性,而且沉淀比较完全,因此应用范围较广。但是,它也受各种因子如pH、离子强度、蛋白质浓度以及聚合物分子质量的影响。PEG的相对分子质量多在2000~6000,多数人认为PEG 6000沉淀蛋白质的效果较好。

用非离子多聚物沉淀蛋白质和微粒,一般有两种方法:①选用两种水溶性非离子多聚物组成液液两相X,不等量分配,而造成分离。此方法基于不同生物分子表面结构不同,有不同分配系数。并外加离子强度、pH和温度等影响,从而扩大分离效果。②选用一种水溶性非离子多聚物,使蛋白质分子在同一液相中,由于被排斥相互凝聚而沉淀析出。该方法操作时先离心除去大悬浮颗粒,调整溶液pH和温度至适度,然后加入中性盐和多聚物至一定浓度,冷贮一段时间,即形成沉淀。

王大虎 (五)结晶沉淀法

蛋白质沉淀可分为晶体沉淀和无定形(非晶体)沉淀两大类,前者分子排列有规则,后者分子排列无规则。蛋白质结晶也是一种蛋白质纯化过程。在纯化阶段,当某一纯蛋白质溶液的质量分数达到较高水平(5%~30%)时,只要条件适合,就能产生一定形状的结晶。但当蛋白质溶液中混有杂质时,即使条件适合,也得不到结晶。因此,可用结晶来判断蛋白质的纯化程度。

结晶实质上是在特定条件下,改变溶解度产生沉淀的一种方法。其具体操作是,将欲结晶的物质溶解于适当溶剂中,然后在此溶液中加入适量的盐或有机溶剂,使欲结晶物质的溶解度降低至接近饱和的临界浓度或刚刚开始出现微弱的浑浊,同时调节pH至pI附近,控制温度在4℃左右,使溶解度进一步降低,经过一定时间的陈化,即可得到结晶沉淀。另外,对于难结晶的物质,有时采用加入少量“晶种”引子,或进行适当搅拌,或在容器壁上用玻棒轻轻摩擦等办法,对结晶形成有加速作用。

 

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