王大虎

王大虎:抗体粗分离的方法

蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度,以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。当用中性盐加入蛋白质溶液,中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质,于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。同时中性盐加入蛋白质溶液后,由于离子强度发生改变,蛋白质表面电荷大量被中和,更加导致蛋白溶解度降低,使蛋白质分子之间聚集而沉淀。

用X铵盐析法从血清中分离纯化IgG的操作步骤可按图7-2进行。

图7-2 用X铵盐析法纯化IgG的流程

王大虎  2.冷酒精沉淀法

冷酒精沉淀法分离过程如图7-3所示。

图7-3 用冷酒精沉淀法纯化IgG、IgA和IgM的流程

王大虎 3.辛酸/X铵法

在酸性条件下(pH4.5),非IgG的蛋白质成分(包括白蛋白,部分Ig),能被辛酸等短链脂肪酸沉淀,上清液中剩余的蛋白质主要为IgG,再用X铵沉淀上清液,即可获得纯度较高的IgG。辛酸/X铵法比X铵盐析法能够获得更高纯度的IgG。

步骤如图7-4所示。

表7-1 从几种动物和人血清沉淀中分离IgG的条件

图7-4 用辛酸/X铵法纯化IgG的流程

王大虎 三、抗体细分离的方法

1.DEAE-Sephadex A-50柱层析法(DEAE-C层析法)

(1)原理 DEAE-Sephadex A-50(二乙氨基乙基-葡萄糖凝胶A-50)为弱碱性阳离子交换剂。用NaOH将Cl-型转变为OH-型后,可吸附酸性蛋白。血清中的γ球蛋白属于中性蛋白(等电点为6.85~7.5),其余均属酸性蛋白。pH7.2~7.4的环境中,酸性蛋白均被DEAE-Sephadex A-50吸附,只有γ球蛋白不被吸附。因此,通过柱层析,γ球蛋白在洗脱中先流出,而其他蛋白质则被吸附在柱上,从而便可分离获得纯化的IgG。

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(2)试剂和器材

试剂:①盐析提取的人γ球蛋白;

②0.5mol/L NaOH、0.5mol/L HCl、2mol/L NaCl、10%叠氮化钠;

③DEAE-Sephadex A-50(下称A-50)、PEG;

④0.1mol/L,pH7.4 PBS(配制见盐析部分);

器材:①层析玻璃柱[1.3cm(内径)×40cm(长度)]、滴定铁架、X夹、螺旋夹、尼龙纱(200目);

②普通冰箱、751型紫外分光光度计、电导仪、抽滤装置(包括抽气机、干燥瓶、布氏漏斗、橡皮垫圈、抽滤瓶)、pH计;

③透析袋、坐标纸、滤纸、pH精密试纸;

④量筒、烧杯、试管、吸管、滴管、灭菌小瓶等。

(3)操作步骤

①A-50预处理:称A-50 5g,悬于500mL蒸馏水内,1h后倾去上层细粒。按每克A-50加0.5mol/L NaOH 15mL的比例,将A-50浸泡于0.5mol/L NaOH液中,搅匀,静置30min,装入布氏漏斗(垫有2层滤纸)中抽滤,并反复用蒸馏水抽洗至pH呈中性;再用0.5mol/L HCl以相同操作过程处理,最后以0.5mol/L NaOH再处理一次。处理完后,将A-50浸泡于0.1mol/LpH7.4 PBS中过夜。

②装柱、平衡、加样、洗脱和收集:详见第六章。

③测蛋白质:分别测定每管OD280,与OD260,按公式计算各管蛋白质含量。并以OD280为纵坐标,以试管编号为横坐标,绘制洗脱曲线。

④IgG的纯度鉴定可采用下列方法之一鉴定:

区带电泳:玻片琼脂或醋酸纤维膜电泳均可。加样电泳后,只在γ-球蛋白的迁移部位出现一条带。操作时,同时可用全血清样品,不同浓度X铵盐析样品进行电泳,以资比较。

琼脂双相双扩散鉴定:预先准备该IgG免疫异种动物所获的抗IgG血清。将IgG与抗IgG血清进行双相双扩散,如IgG提纯的话,则在两样品孔之间出现一条沉淀线。

免疫电泳鉴定:孔内加待测样品,电泳后,在槽内加抗IgG血清,琼脂扩散24h,观察结果。如果提取的IgG纯的话,则只出现一条弧形的沉淀线,且沉淀线位于γ-球蛋白区。此鉴定必须同时进行全血清及抗血清抗体的免疫电泳,以资比较。

圆盘电泳鉴定:用全血清样品及提纯样品同时进行圆盘电泳。全血清样品在圆盘电泳上出现数十条区带,而纯化的IgG则只有一条区带。

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