大虎说事

王大虎:注意事项

(4)注意事项

①柱的选择:从理论上说,只要柱足够长,就能获得理想的分辨率,但由于层析柱流速同压力梯度有关,柱长增加使流速减慢,峰变宽,分辨率降低。柱的直径增加,使流体流动的不均匀性增加,分辨率明显下降。

②纯化过程必须严格控制缓冲液的pH及离子强度。样品与A-50必须用洗脱缓冲液彻底平衡后,才能进行柱层析。

③所装的柱床必须表面平整,无沟流及气泡,否则应重装。

④洗脱过程中应严格控制流速,切勿过快。

⑤上样的体积要小,浓度不宜过高。

⑥加样及整个洗脱过程中,严防柱面变干。

2.SPA-Sepharose CL-4B亲和层析法

(1)原理 葡萄球菌蛋白A(Staphylococal Protein A,SPA)是一种从金黄色葡萄球菌细胞壁中分离的蛋白质,具有与多种哺乳动物IgG分子Fc段结合的能力,并与不同IgG亚类的结合力有所差别。改变pH及离子强度可洗脱结合于SPA-Sepharose CL-4B柱上的IgG或不同的IgG亚类,可直接纯化血清或小鼠腹水中的IgG抗体。

(2)试剂器材

SPA-Sepharose CL-4B

0.1mol/L PBS,pH8.6加0.02%叠氮化钠

柠檬酸缓冲液:

大虎说事
大虎说事

 

再生缓冲液:

a.0.1mol/L Tris含0.5mol/L NaCl调整pH至8.6加0.02%叠氮化钠;

b.0.1mol/L乙酸钠含0.5mol/L NaCl调整PH至2.2加0.02%叠氮化钠。

(3)操作步骤

①用0.1mol/L,pH8.6 PBS浸泡SPA-Sepharose CL-4B凝胶15min。按1g干胶:200mL上述缓冲液充分洗涤凝胶(用玻璃漏斗过滤或置烧杯中洗涤)。装柱后用0.1mol/L,pH8.6 PBS平衡。

②标本可用X铵粗提物,先10000r/min离心20min除去杂质,必要时用0.22µm滤膜过滤,上样前用1mol/L,pH9.0 Tris-HCl液调整标本液pH至8.6或对平衡液透析过夜。

③加样,一般按25~30mg IgG/(g湿胶)比例加样,室温作用15min,用0.1mol/L,pH8.6 PBS充分淋洗,到淋洗液OD值为小于0.02。

④用不同pH的柠檬酸洗脱液洗脱,流速20mL/h。如纯化小鼠IgG1一般用pH5.5;纯IgG2a用pH4.0;纯化IgG2b用pH3.0。

⑤用再生缓冲液b洗脱剩余蛋白,洗脱后用再生缓冲液a平衡完成再生。

⑥收集洗脱液测OD值,根据实验需要透析除盐X行浓度、纯度和活性测定。

(4)注意事项

①SPA-Sepharose CL-4B凝胶价格昂贵,可再生后反复使用10~20次左右。再生方法先用10倍柱体积0.1mol/L、pH8.6 Tris含0.5mol/L NaCl溶液洗脱柱上的残存杂蛋白;再用10倍柱体积0.1mol/L、pH4.5醋酸钠缓冲液含0.5mol/L NaCl溶液洗脱柱上的残存杂蛋白;0.1mol/L、pH8.0磷酸缓冲液平衡,4℃贮存。

②SPA-Sepharose CL-4B亲和层析法还可用于:除去抗X中IgG,检测非IgG抗体(如IgM)的生物学活性;除去木瓜蛋白酶或胃蛋白酶水解IgG后的Fc段;吸收或纯化免疫复合物。

③狗、猫的多克隆IgM和IgA以及单克隆IgM和IgA也具有与SPA结合的能力。

3.Con·A-Sepharose 4B柱层析法

Con·A-Sepharose 4B层析柱[1cm(内径)×14cm(长度)]经pH7.5浓度0.05mol/L Tris-HCl缓冲液充分平衡后,上样已经透析、平衡、X铵初步纯化的IgG溶液,分离得到的IgG和部分糖蛋白,再用其他层析方法进行分离,也可得到均一的γ-球蛋白。

4.抗原-Sepharose 4B亲和层析法

把抗体物质对应的抗原制成均一物质后,与CNBr活化的Sepharose 4B偶联,即可获得抗原-Sepharose亲和吸附剂。将其装入小体积层析柱,用适当缓冲液平衡后,上样已经透析、平衡、X铵初步纯化的IgG溶液,通过一定离子强度的缓冲液洗脱,就能得到专一的IgG制品。

 

发表评论

电子邮件地址不会被公开。 必填项已用*标注