王大虎

王大虎:膜蛋白的分离

一般情况下,膜蛋白的分离纯化及研究流程如图7-11所示。

图7-11 膜蛋白的纯化及研究流程

(一)膜的处理

膜的处理包括:

(1)细胞破碎 采用渗透压、超声、机械、冻融、酶处理(溶解酶、DNA酶)等方法。

(2)膜分离 采用超速离心、分子筛等方法。

王大虎  (二)膜蛋白的溶解

采用去垢剂将疏水蛋白从其膜结构中溶解下来,膜在去垢剂的作用下可变成蛋白质-脂-去垢剂的复合物而被溶解。优化溶解条件需考虑最佳蛋白质与去垢剂浓度比、最佳增溶时间、最佳pH和最佳离子强度;同时考虑不同去垢剂的混合以及是否需要添加脂肪等。

膜蛋白的溶解方法取决于蛋白质与磷脂双分子层的缔合模式。溶解内周膜蛋白时,选择合适的去垢剂破坏细胞膜。对于具有多个跨膜区域或脂质部分(如X蔻酸酯、棕榈酸酯或异戊二烯基团)共价结合的蛋白质,必须用去垢剂破坏膜结构。去垢剂的选择取决于溶解目的蛋白以及维持蛋白质活性构象的有效性、实用性和成本。虽然曲拉通X-100是一种常用于溶解膜蛋白质的去垢剂,但其主要的缺陷是具有较高的紫外线吸收。使用去垢剂后,在随后的纯化过程中,所有的缓冲液都必须含有该去垢剂,否则由于疏水部分的聚集及其在色谱柱和器皿表面的非特异性结合,几乎肯定会引起蛋白质的损失。对于具有单一跨膜区域的膜蛋白,可用去垢剂将其从膜上溶解。而对于内周膜蛋白(多肽链大部分位于膜某一侧的蛋白质),可以通过改变缓冲液离子强度或使用酶裂解(可用胰蛋白酶或木瓜蛋白酶)。许多哺乳动物的糖基化磷脂酰肌醇(GPI)定位蛋白容易被细菌磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)所释放,细菌PI-PLC可选择性裂解GPI。由于有限的蛋白酶裂解,只有部分膜蛋白被细菌PI-PLC释放,因而获得了有效的初始纯化,而且释放的蛋白质形式也是亲水的。

王大虎
王大虎

 

王大虎   (三)膜蛋白的分离

实例1:组织质膜蛋白质的分离

①取组织,加入10mL缓冲液A[0.32mol/L蔗糖、5mmol/L Tris-HCl(pH7.5)、120mmol/L KCl、1mmol/L EDTA、0.2mmol/L PMSF、1µg/mL亮肽素、1µg/mL胃蛋白酶抑制剂A、1µg/mL木瓜蛋白酶抑制剂冰上预冷]于冰上充分匀浆。

②于3000r/min,4℃离心10min后,所得上清液转入超速离心管。

③于100000r/min,4℃离心1h。弃去上清,沉淀用适量的缓冲液B[20mmol/L Hepes(pH7.5)、10%甘油、2%曲拉通X-100、1mmol/L EDTA、0.2mmol/L PMSF、1µg/mL亮肽素、1µg/mL胃蛋白酶抑制剂A、1µg/mL木瓜蛋白酶抑制剂。冰上预冷。]重悬,冰上预冷2h后分装至EP管,Eppendorf台式离心机于12000r/min,4℃离心30min。

④收集所得上清液即为质膜蛋白质。

⑤粗制的样品可于干冰/乙醇中速冻,保存于-80℃。

实例2:细菌膜蛋白的分离

①于20mL营养肉汤中过夜培养细菌,37℃,1500r/min。

②于10000r/min、4℃离心20min,去上清液。

③20mL预冷的Tris-Mg缓冲液重悬,同样条件离心,再重悬于预冷的Tris-Mg缓冲液[10mmol/L Tris-HCl、5mmol/L MgCl2,pH7.3、4℃保存]。

④超声波破碎细菌。

⑤于3000r/min、室温下离心10min后去除未破碎细菌。小心吸取上清液(含有胞质成分和细菌外被成分)。

⑥超速离心Ⅰ:100000r/min,4℃下离心60min,去除上清液(胞质成分),收集细菌外被成分。

⑦用10mL含2g/L的十二烷基肌氨酸钠(SLS)的Tris-Mg缓冲液重悬沉淀物,室温温育20~30min。

⑧超速离心Ⅱ:于70000r/min、室温下离心60min沉淀收集外膜蛋白,去除上清液(含细胞质膜)。

⑨重复⑦、⑧两步。充分吸除上清液,并根据沉淀体积大小用0.1~0.2mL的重蒸水重悬沉淀物。样品于-70℃贮存。

实例3:细胞膜蛋白的分离

①冰上刮下细胞后将细胞溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液A[缓冲液A:1mmol/L KCl、5mmol/L NaCl、3mmol/L MgCl2、50mmol/L Hepes、1mmol/L DTT、0.5µg/mL亮肽素、20µmol/L PMSF(pH=7.4)]中,于室温在液氮罐中反复冻融2次。

②于3000r/min,4℃离心20min,去除核及未裂解的细胞。

③取上清液于15000r/min,4℃离心10min,取沉淀溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液B[缓冲液B:1mmol/L KCl、5mmol/L NaCl、3mmol/L MgCl2、50mmo/L Hepes、1mmol/L DTT、0.5µg/mL亮肽素、20µmol/L PMSF(pH=7.4)、1mmol/L EGTA]中。

④于15000r/min,4℃离心10min,取沉淀溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液C[缓冲液C:0.5µg/mL亮肽素、20µmol/L PMSF、50mmol/L Tris-HCl(pH=7.0)]中即为细胞膜蛋白,-20℃保存备用。

(四)膜蛋白纯化方法

膜蛋白的纯化方法主要有离心、电泳和色谱技术等:

①密度梯度离心:适用于中等以下规模;低分离度;适合于酶动力学研究。

②凝胶过滤:适用于中等以下规模;低分离度;适合于酶动力学研究。

③HIC:适用于小规模;分离度中等偏下,应用有限制;介质费用中等。

④IEC或者疏水色谱:适用于大规模或者小规模;中等分离度;介质费用低。

⑤固定化离子亲和色谱:适用于小规模;中等分离度;介质费用中等。

⑥非变性电泳:适用于小规模;高分离度;可得高纯度的蛋白质,可用于制备抗体或者测序;不适合酶动力学研究。

⑦非变性等电聚焦:适用于小规模;高分离度;可得高纯度的蛋白质,可用于晶体化。

⑧共价色谱:适用于小规模;高分离度但是应用有限制;介质费用中等。

⑨色谱聚焦技术:适用于小规模;高分离度;介质费用高。

⑩染料亲和色谱:适用于小规模;高分离度;介质费用中等。

⑪配体亲和色谱。适用于小规模;非常高的分离度;介质费用高。

进行膜蛋白的纯化,一般要用两种以上的色谱方法,才能获得电泳纯的成分。若样品含蛋白种类较多,需要用其他方法去除一些非目的蛋白。

 

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