王大虎

王大虎:钙调蛋白的分离

利用CaM溶解度高(可大量溶解于稀的中性水溶液中),分子小、带净负电荷和钙依赖性疏水行为有别于其他蛋白质的性质,设计CaM的纯化策略分三步进行,每步利用上述性质中的一种。分离纯化流程图如图7-15所示。

 

图7-15 CaM分离纯化的流程图

 

 

三、钙调蛋白的检测

 

(一)CaM的活性测定

CaM活性测定法可分为两大类,一是用放射免疫测定法(RIA)直接测CaM含量;另一类是依据以钙依赖性方式激活多种酶类[如环核苷酸磷酸二酯酶(PDE)],利用PDE系统,由被CaM激活的PDE间接测定CaM的活性,再推算出CaM含量。这两类方法的测定敏感度都在1~100pmol水平。相比较RIA法是以125Ⅰ-标记CaM和CaM的特异性抗原-抗体反应作为测定的基础,特异性强,不受其他的酶或内源性抑制蛋白的干扰,但所测得的是CaM含量,而不代表CaM的生物活性(包括有生物活性和无生物活性的部分)。PDE法是以CaM的生物活性为基础,方法简便,组织提取物经简单的热处理即可除去几乎所有的酶或蛋白,但测定的不是CaM的总含量,结合的或无活性状态的CaM不能被测出,另外尚需注意内源性抑制因子可能会影响测定结果。

特异的依赖于CaM的PDE是测定CaM活性的基础。CaM能以钙依赖性方式激活多种酶类,包括PDE、若干蛋白激酶、蛋白磷酸酶、Ca2+/Mg2+ATP酶和NAD激酶。CaM激活PDE没有组织和种属特异性,从一种组织提取的PDE,可以用来测定任何来源CaM的活性。实验中所用PDE是由牛心制备的,在一定范围内PDE活性与CaM量成比例关系,PDE活性测定又根据所加底物和测定的最终产物不同而分成不同类型;以非同位素标记的cAMP作为底物,经PDE水解成为5′-AMP之后,再经蛇毒将5′-AMP进一步定量的水解成为无机磷和腺苷,测定产物中无机磷在660nm波长的光吸收率,计算出CaM活性,或把5′-AMP定量的转化成ATP,再用荧光技术测定ATP,计算CaM活性;其次可以用3H-cAMP(3H-cGMP)作为底物,经PDE和蛇毒相继作用后,用QAE-SephadenA-25柱层析法分离,测定底物中3H-Adenosine的含量,也可以计算出CaM活性;此外,5′-AMP也可以被5′-腺苷酸脱氨酶作用,生成5′-IMP,于256nm测OD值变化,计算CaM活性。

王大虎
王大虎

PDE法测定活性步骤:把一系列试管置冰浴中,按顺序分别加入下列试剂:100µL测定缓冲液、20µL 4.5mmol/L CaCl2(或4.5mmol/L EGTA)、10U/20µL PDE、100µL CaM(0~10ng)。随之加入50µL3H-cAMP溶液(约250pmol)后立即置30℃水浴中开始反应,15min后取出,转入100℃水浴中煮沸3min终止反应,冰浴中冷却后加10%蛇毒10µL,再于30℃水浴温育15min,加2.5mmol/L Adenosine 700µL,QAE-SephadexA-25柱(0.7×4cm)层析分离,上样后加4mL 20mmol/L甲酸铵洗脱,收集洗脱液取1.5mL加入10mL甲苯-曲拉通(2∶1体积比)闪烁液,摇匀、闪烁计数,计算每分钟cAMP水解量,绘制CaM标准活性曲线。把在30℃时,使10U PDE达到1/2最大活性所需的CaM量定为1个CaM活性单位。组织样品中CaM活性测定:取待测组织称重,放入EDTA缓冲液中匀浆(10mg/mL)后,100℃沸水浴中煮3~5min,于30000r/min、离心60min。取上清液调成2mmol/L CaCl2溶液,用测定缓冲液适当稀释后测定CaM活性。每次测定包括无CaM的PDM基础活性管、10ng CaM的PDE最大活性管和加EGTA的PDE活性测定管。

PDE法测定方法的敏感度:在进行标准CaM活性测定的同时,增设CaM含量为0.1ng的管10支,测定的结果与PDE基础活性管(即不含CaM的测定管)相比较,进行t测验(检测两个样本差异性的统计方法)。该方法的灵敏度可达到0.1ng。

虽然CaM最初被鉴定为是PDM的激活因子,但现在并没有令人信服的理由在其测活试验中非用这种酶不可。也可选择用蛋白激酶测活,因为这种测活方法将产物吸附于磷酸纤维素纸上,可对大量结果进行快速分析。这一测活方法的特异性在于利用提纯的酶(外加的)及特异的底物肽,将不同浓度的CaM用于平滑肌肌球蛋白轻链(myosin light chains, MLC20)的磷酸化反应,以等剂量的CaM标准品为对照,观察各组MLC20磷酸化程度。反应条件如下:20mmol/L Tris-HCl(pH7.4)、1mmol/L DTT、5mmol/L MgCl2、60mmol/L KCl、2mmol/L ATP、4mmol/L肌球蛋白、0.2mmol/L肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase, MLCK)、0.1mmol/L CaCl2。加入CaM样品与CaM标准品(浓度可为0.1~10µg/mL不等),于25℃下温育20min,用甘油电泳检测各组MLC20磷酸化程度,用Scoin Image密度扫描软件分析各组MLC20磷酸化百分率。

从理论上讲任何一种被CaM特异性激活的酶都可以用来测定CaM的活性,其中,由于PDE比较容易分离提纯,而且PDE系统比较敏感,因此被广泛应用。CaM测活中最常用的两种蛋白激酶是CaM激酶Ⅱ和MLCK。这两种酶有一个优点是它们能在温和的条件下与内源性CaM分离并纯化,因此被测的组分可返加回去,以测定对钙依赖性激活作用的活性。其他的蛋白激酶,如磷酸化酶激酶,就不大方便,因为它们与内源性CaM结合得太紧。此外,磷酸化酶激酶的激活动力学因其调控亚基的磷酸化需要附加条件而变得较为复杂。

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