王大虎

王大虎:CaM的鉴定

(1)紫外吸收 测定每个收集管中的OD280值,绘图并确定高峰位置。再用紫外吸收图谱分析仪对高峰位置和次高峰位置中的溶液分别进行扫描测试,与标准CaM的紫外吸收图谱进行比较确定。

(2)电泳法 十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),观察在分子质量大小约为16.8ku的区域是否出现一个单一的钙调蛋白的条带。此外,用于CaM的电泳法还有:无去垢剂的非变性PAGE和分析折叠状态的尿素梯度PAGE等。

王大虎 第四节 生物活性酶的纯化

 

一、尿激酶的纯化

 

(一)尿激酶的性质

尿激酶(Urokinasc,简称UK,EC-3.4.21.31)最初从尿中检出而得名,后来发现它广泛地存在于哺乳动物和人的X、血浆中,此外在恶性增生的前列腺组织和肾细胞培养物中也能发现。

UK是一种糖蛋白,属丝氨酸蛋白酶类,它的天然蛋白质底物是纤溶酶原,催化纤溶酶原中Arg560-Val561肽键断裂而形成纤溶酶。UK在人体内半衰期约为15min,50%被肾脏消除,其余由肝脏分解。部分UK能够迅速进入血栓内部,激活血栓中的纤溶酶原,转变为纤溶酶,后者又催化不溶性的纤维蛋白(血凝块的主要成分之一)降解成可溶性的碎片,从而起到局部溶栓作用;另一部分UK则激活循环X中的纤溶酶原产生过量的纤溶酶,从而导致循环中的纤维蛋白原、凝血因子V等降解引起全身纤溶亢进而可能导致X。UK对新鲜血栓溶解迅速、有效,对陈旧性血栓效果相对较弱。此外,UK还有酯解和酞胺解活性,能水解一系列精氨酸或赖氨酸的酯和酞胺。

王大虎  (二)尿激酶粗品的提取

UK通常是从健康男性新鲜X分离或培养的肾组织细胞培养得到,前者因原料易得、价格便宜而被广泛采用。尿是肾脏生成的X物。X是指机体把新陈代谢过程中所产生的代谢终产物,以及摄入体内过量的有用物质(如无机盐类和水)和药物、异物等,经由血液循环的运输,从不同的途径排出体外的生理过程。而由肾脏X的物质种类最多,数量最大,而且可以随着机体的不同情况、摄入物质的不同出汗多少等因素而改变。正常人一昼夜排出的尿量为1~2L。XpH为5.0~7.0,相对密度为1.015~1.025。尿中水分为95%~97%,固体物质为3%~5%,后者又可分为有机物和无机盐两大类。有机物中主要是尿素,其余为肌酐、尿酸、尿色素、维生素等;无机盐主要是NaCl,其余为X盐、磷酸盐和钾、铁等盐类,UK含量为5~7IU/mL。

UK的初步浓缩大致过程如下:收集24h内的健康男性新鲜X,向X通气发泡,使泡沫从上口溢出。收集泡液,滴加适量消泡剂,如硅油消泡,可以得到浓缩10倍左右的X。用NaOH调节pH至7.5,于低温静置除去沉淀杂质,上清液调节pH至6.5。按0.5~1.0g/mL的比例加入硅藻土,搅拌完全后将吸附了UK的硅藻土用蒸馏水冲洗。然后加入4%的氨水解吸,向洗脱物加入固体X铵至60%饱和度,低温静置过夜。收集离心分离的沉淀,用蒸馏水溶解,不溶物离心除去,上清液冷冻干燥,可得黄色粉末状UK粗酶,活力为100~1000IU/mg。得到的粗酶进一步加工通常采用亲和方法,尤其以亲和色谱为主。

采用锌离子从尿中沉淀UK粗品,是沉淀法的一种。取新鲜男性尿6L,分7份,加入ZnCl2使之浓度分别为1mmol/L、2mmol/L、3mmol/L、4mmol/L、5mmol/L、10mmol/L、15mmol/L和20mmol/L,调节pH6.5~7.0,搅拌10min,放置1h,移去上清液,过滤沉淀。Zn2+浓度对UK活力和沉淀量的影响如图7-16所示,当Zn2+浓度在1~3mmol/L,沉淀酶活力随Zn2+浓度增加而大幅度增加,3mmol/L时达85%以上,而沉淀的质量为1.5g。在3mmol/L以上,随着Zn2+浓度增加,沉淀UK总活力趋近极限,而沉淀物的质量的增加仍较明显,较酶活增加幅度大。这说明在较低浓度时,Zn2+有一定的选择沉淀UK的作用。控制Zn2+浓度在3mmol/L,可得到85%~92%的UK回收率,而沉淀物的量并不多,便于工艺处理。

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图7-16 Zn2+浓度与UK活力及沉淀量的关系

(资料来源:曹学君,1998)

X铵溶液的pH对UK溶出的作用,如图7-17所示。随着pH递增,UK溶出效果逐渐增加,在pH10~10.5达到7.84×105IU/L。若继续增加pH,氨水用量会大幅度上升,UK溶出已不再增加。在pH10~10.5,UK已经接近完全溶出,而氨水用量不大。

 

王大虎 图7-17 不同pH的20g/LX铵溶液对UK溶出作用的影响

(资料来源:曹学君,1998)

盐析饱和度的确定如表7-2所示。20g/LX铵溶解UK沉淀,使X铵达到不同饱和度,盐析8~10h,倾去上清液,过滤沉淀,用4倍量0.05mol/L Na2HPO4溶解,测定酶活与蛋白质含量。

表7-2 溶出液在不同饱和度X铵中的UK的盐析结果

 

由表可知,最佳工艺参数为:溶解液用70%饱和度的X铵盐析,UK盐回析收率为91%,粗品纯度为4.08×105IU/g,固体效价为3.6×105IU/g,总收率在77%~82%。每吨尿(5.00×106IU计)可得UK粗品(3.8~4.1)×106IU。

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