王大虎

王大虎:尿激酶的纯化

UK的纯化,除了使用传统的色谱法,还通常采用亲和色谱的方法,常用的亲和配体包括单克隆抗体、天然抑制剂、合成抑制剂、含有精氨酸的寡肽以及其他含有脒基或胍基的化合物。几种色谱方法结合才能更完全的纯化UK。下面以分离高分子质量和低分子质量UK来阐述UK的纯化方案。

王大虎  称取1g UK粗品,溶于50mL蒸馏水中,离心除去不溶物,取上清液用起始缓冲液透析,用0.45µm滤膜过滤,苯甲脒柱用起始缓冲液平衡后上样、平衡,用洗脱缓冲液洗脱并分部收集,2.3mL/管。洗脱曲线见图7-18所示。

 

图7-18 苯甲脒-Sepharose 6B亲和柱纯化UK

(资料来源:叶峰,2004)

合并5~13管的组分(约20mL),用Sephadex G-25除盐,上SP(强阳离子交换)柱。SP柱预先用平衡缓冲液平衡,上样后用平衡液平衡至基线稳定,进行梯度洗脱,图7-19所示,收集洗脱峰。收集图7-19中峰1(洗脱体积65~80mL)为LUK,收集峰3(145~176mL)为HUK。SDS-PAGE鉴定结果,图7-20表明,HUK和LUK均呈单一条带,位置分别在54ku和33ku。

 

图7-19 Protein-Pak SP柱分离HUK和LUK

(资料来源:叶峰,2004)

 

图7-20 HUK和LUK的SDS-PAGE图谱

(资料来源:叶峰,2004)

采用考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度,纤维蛋白平板法测定活力得到纯品的比活,HUK为2.9×105IU/mg蛋白,LUK为3.5×105IU/mg蛋白。分离纯化的结果见表7-3所示。

表7-3 UK纯化结果

大虎说事
大虎说事

(1)UK的米氏动力学常数测定 用Marquardt-Levenberg算法,以对v对[S]作非线性拟合得到以下拟合结果,如图7-21所示,HUK: Km=63.2µmol/L,Vm=73.2nmol/(L·s);LUK: Km=49.4µmol/L,Vm=45.8nmol/(L·s)。

 

图7-21 UK水解显色底物S-2444的HUK和LUK的Km测定

(资料来源:叶峰,2004)

(2)UK水解底物S-2444的kcat值测定 实验中测得不同酶浓度下的反应初速度(3次数据平均值),得到[E]-v数据,由公式Vm=(Km+[S])/[S],计算可得到[E]-Vm关系,对[E]作图7-22,得到的直线斜率即是kcat;HUK的kcat值为15.4/s,LUK的kcat值为13.3/s。其中[E]表酶浓度,Vm表最大反应速度,v表反应速率,km表米氏常数,[S]表底物浓度,kcat表酶的转化系数。

 

图7-22 UK水解显色底物S-2444的kcat值测定

(资料来源:叶峰,2004)

(四)尿激酶活力的检测方法

UK的活力有多种检测方法,典型的如纤维蛋白平板法、冒泡法、荧光光度法和可见光光度法等。

1.纤维蛋白平板法

本方法是测定UK纤溶性。先制备含纤维蛋白原、纤溶酶原的琼脂糖混合液,与凝血酶溶液混合后冷藏备用。测试时在涂有上述混合液的表面皿上用特制的打孔器加入标准和未知的UK样品。37℃保存16h后用游标卡尺测定溶圈大小。理论上UK活力与溶圈面积的对数成正比。此方法主要缺点为操作复杂,且影响因素较多,容易产生不必要的误差。

王大虎 2.冒泡法

冒泡法与纤维蛋白平板法原理基本相同,不同之处主要在于测量数据为UK溶解凝结了的蛋白质溶液,使其中的气泡上升的时间。理论上UK活力与气泡上升的时间成正比。

王大虎 3.荧光光度法和可见光光度法

利用UK的酞胺解活性,催化酞胺水解为羧酸和胺,而后者具有荧光和/或吸收可见光的性质,其荧光值或吸光度在一定范围内与UK活力成正比,从而可快捷地测量UK的活力。如显色底物S-2444在UK的催化下发生以下反应:

 

对硝基苯胺在405nm处有特征吸收峰,因此可以灵敏地测定UK的活力。这两种方法操作方便,缺点在于荧光试剂和显色剂价格昂贵。

 

 

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