王大虎

王大虎:激肽释放酶的纯化

(一)激肽释放酶性质

激肽释放酶(kallik rein,简称KLK),属丝氨酸蛋白酶的一种,存在于各种组织和生物液体中。KLK可催化大分子前体物(激肽原,kininogen)释放生物活性肽(激肽,kinin),也称之为激肽原酶(kinino-genases)。目前,KLK主要分为两大类,即血浆激肽释放酶(PK)和组织激肽释放酶(TK),两者在其分子质量、底物特异性、免疫生物学特性、基因结构以及所释放的激肽类型等方面均存在明显差异。KLK作为一种蛋白酶,不仅可催化前体物释放生物活性肽,且组成其家族的各个成员在基因和蛋白质结构中都具有高度的功能保守性和序列同源性,具有相同的染色体定位。其中TK是一个大的多基因家族,由15个成员组成,各成员间基因序列、蛋白水平、三级结构极为相似。“人激肽释放酶”泛指“TK”。

(二)激肽释放酶结构

人KLK基因长4~10kb,其差异大多在于内含子的长度不同。常见结构特征有:①外显子的长度或相近或相等。所有基因在DNA和氨基酸水平上具有高度同源性(40%~80%);②各基因中均含有催化三联体残基(组氨酸、天冬氨酸、丝氨酸残基)的丝氨酸蛋白酶。通常情况下,组氨酸位于第2个外显子近末端。天冬氨酸位于第3个编码外显子的中间。丝氨酸残基位于第5个外显子起始处;③所有KLK蛋白均以前肽的形式合成,在N末端带有一个长17~20个氨基酸的信号肽,其后紧接4~9个氨基酸的活性肽,再连接有酶促活力的成熟蛋白;④底物结合位点氨基酸通常是天冬氨酸(指示11种类胰蛋白酶特异性)或其他活性氨基酸;⑤大多数基因受类固醇激素的调节;⑥均含有10~12个半胱氨酸残基,即可形成5~6个二硫键。

(三)激肽释放酶粗分离

猪胰脏中KLK含量较高,来源丰富。工业化生产中通常以猪胰脏为原料制备KLK,粗分离流程一般为:将猪胰脏绞碎,加缓冲液提取,过夜搅拌活化,压滤,丙酮沉淀,脱脂脱水干燥,得KLK粗酶。通过提取缓冲液中添加Ca2+激活KLK,可缩短操作时间,提高KLK提取效果。KLK粗分离流程图如7-23所示。

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图7-23 KLK粗分离流程

采用加入活化剂2.5%CaCl2的HCl溶液用于粗酶制品的提取,是由于Ca2+对胰酶有激活作用,并且能保护胰酶的活力,这样可使胰酶粗品的收率提高3%。同时,丙酮对沉淀该酶有较好的专一性,使与酶共同沉淀的杂质较少,因而当粗品溶于乙酸缓冲液后,过滤时滤速较快,滤液清亮,克服了滤液浑浊、滤速慢的问题。

(四)激肽释放酶的细分离

在KLK的细分离时,一般以来源比较广泛的猪胰脏为原料提取纯化TK,主要分离纯化方法有有机溶剂或盐分级沉淀、凝胶过滤、离子交换、亲和色谱等。

王大虎  1.离子交换

离子交换以其操作简单、快捷、费用低、纯化效果好等特点,已经成为蛋白质纯化技术中应用最为广泛的一种方法。对于KLK的分离纯化,各种类型的离子交换色谱也被广泛应用。

例如,用Amberlite IRA-938强碱性大孔径阴离子交换树脂分离猪胰酶粗品中的KLK,得到的纯化样品比活达到了112U/(mg蛋白质),得率为79.5%,纯化倍数为23.1倍。在实验过程中流动相的流速可以达到200250mL/h,这样就大大减少了操作时间。

用DEAE-纤维素阴离子交换树脂,并采用搅拌吸附的方法。洗脱液用有机溶剂丙酮以及X沉淀,干燥得到纯化样品。得到的纯化样品比活为680kU/(mg蛋白质),活力回收达到80%,纯化倍数在200倍以上。

用弱酸性阳离子交换树脂Amberlite CG50树脂代替DEAE-纤维素,由搅拌吸附改为柱层析,来纯化激肽释放酶。层析时的流速控制为20~30mL/min,层析结果纯化样品酶比活可以达到107.4U/mg蛋白质。

王大虎  2.亲和层析

与KLK具有较好亲和性的蛋白质配基比较多,例如抑肽酶、亮抑肽酶(亮抑制素)、对-氨基苯甲脒等,但抑肽酶和亮抑肽酶存在价格昂贵、稳定性差、难复性等缺点。相比之下,对-氨基苯甲脒作为化学合成物,价格便宜、性质稳定、特异性吸附强,以及吸附量大,相应载体偶联技术也相对成熟,更适合工业化生产。例如,将激肽释放酶粗酶经过DEAE-Sepharose 4B离子交换和对-氨基苯甲脒-Sepharose 4B亲和层析纯化,所得KLK产品比活为300kU/(mg蛋白质)。相对用DEAE-Sepharose 4B离子交换纯化倍数为6倍来说,对-氨基苯甲脒-Sepharose 4B亲和色谱纯化倍数约为45倍。KLK活力回收率为56%~59%。

王大虎  3.疏水层析

用疏水层析的方法分离提纯猪胰KLK时,在层析剂基质与起吸附作用的功能团之间接上一段直链碳链,它可与蛋白质表面某一对应疏水区域相互作用,增加对蛋白质的吸附能力,显著提高蛋白质的分离效果。

操作时选用三种不同的疏水树脂Octyl Sepharose FF、Phenyl Sepharose FF和Butyl Sepharose FF来进行分离。首先进行盐析操作,将盐析后的蛋白质溶解后再加入X铵,就可作为疏水层析的样品进行疏水层析。三种疏水树脂的操作结果为Butyl Sepharose FF树脂的纯化效果最好,比活大于500U/mg。此方法不但操作简单,而且纯化效果显著,是一种可以优先选择的分离方法。

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