王大虎

王大虎:激肽释放酶的酶活测定

KLK能水解酯键、酰胺键和肽键,根据这一性质,目前广泛用于检测KLK活力的底物主要是N-苯甲酰-L精氨酸乙酯(BAEE)。BAEE在波长253nm下的紫外吸收远远弱于N-苯甲酰-L精氨酸(BA)的紫外吸收。在KLK催化水解下,BAEE随着酯键被水解,水解产物BA逐渐增多,反应X的紫外光吸收值也随之相应增加,以ΔA253计算KLK的活力。

除了紫外光吸收差值法,免疫荧光检测也常被使用。由于KLK常用免疫荧光特性检测,因此可以根据洗脱液中是否有荧光判断目的蛋白质有没有被洗脱出,避免了非目标蛋白峰不必要的检测操作。

三、植物溶菌酶的纯化

 

王大虎(一)溶菌酶的性质

溶菌酶又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶,是一种葡萄糖苷酶,其化学性质稳定,干燥条件下在室温可长期保存,其纯品为白色或微黄色结晶体或无定型粉末,无臭,味甜,易溶于水,不溶于丙酮、X。溶菌酶是一种作用于微生物细胞壁的水解酶,它能破坏革兰阳性菌的细胞壁,破坏肽聚糖支架,在内部渗透压的作用下细胞胀裂开,引起细菌裂解。有些革兰阴性菌也能受到溶菌酶的破坏。

(二)植物溶菌酶

相对动物和微生物溶菌酶来说,植物溶菌酶的研究相对较少。目前已经从植物如木瓜、无花果中分离出溶菌酶,其分子质量较大,为24~29ku。植物溶菌酶对溶壁小球菌的溶菌活性不超过鸡蛋清溶菌酶的1/3,但对胶体状甲壳质的分解活性则是鸡蛋清溶菌酶的10倍。

王大虎
王大虎

(三)植物溶菌酶的纯化

对溶菌酶具有抗植物病原菌活性的溶菌酶的报道甚少,下面我们以抗细菌抗真菌的植物(绿豆)溶菌酶为例,来分析它的分离纯化过程和活性表征。

1.CM-Sephadex C-50弱阳离子交换色谱分离

绿豆抽提液经过CM-Sephadex C-50弱阳离子交换色谱分离,结果如图7-24所示。由图可以看出,第一个洗脱峰P1与P2能实现基线分离,P2峰是具有溶菌酶活力的组分,收集,透析脱盐,继续分离。

 

图7-24 CM-Sephadex C-50弱阳离子交换色谱图

曲线表示OD280,直线表示洗脱梯度;色谱条件:色谱柱3cm(内径)×30cm(长度),流速:0.3mL/min,20min/管,A液:0.02mol/L,pH5.4的乙酸-乙酸钠缓冲液含0.2mol/L NaCl;B液:0.02mol/L,pH5.4的乙酸-乙酸钠缓冲液含0.4mol/L NaCl;检测波长280nm

(资料来源:汪少芸,2006)

2.POROS 20HS弱阳离子交换色谱

由图7-25可以看出,经过POROS 20HS柱分离,梯度洗脱选择0~0.5mol/L NaCl,可得清楚的三个峰,溶菌酶活力测试表明,图7-25中的hsl就是纯化的抗菌组分绿豆溶菌酶。

 

图7-25 P2组分水浴后在POROS 20HS柱上的色谱图

曲线表示OD280,直线表示洗脱梯度;色谱条件:色谱柱0.75cm(内径)×7.5cm(长度),流速:3mL/min,A液:0.02mol/L,pH6.0的PBS;B液:0.02mol/L,pH6.0的PBS含0.5mol/L NaCl;检测波长280nm

(资料来源:汪少芸,2006)

王大虎  3.毛细管液相色谱

利用毛细管反相液相色谱C18柱[15cm(长度)×0.5mm(内径)]高分辨率、高灵敏度的优点,对绿豆中的溶菌酶组分进行纯度鉴定。鉴定结果如图7-26所示,说明该组分已达到反相色谱纯。

 

图7-26 绿豆溶菌酶的毛细管反相液相色谱图

色谱条件:色谱柱(C18)0.5mm(内径)×150mm(长度);平衡液:0.1%TFA水溶液;洗脱液:0.085%TFA-乙腈溶液;进样量:50µL;流速:1mL/min;检测波长:210nm

(资料来源:汪少芸,2006)

王大虎  4.SDS-PAGE

绿豆溶菌酶的SDS-PAGE结果如图7-27所示,只呈现单一的电泳带,说明纯化的溶菌酶已达到了电泳纯。

 

图7-27 溶菌酶SDS-PAGE图

电泳条件:15%分离胶,恒压:120V,考马斯亮蓝染色

电泳带从左至右为:标样(M),分子质量从上至下依次为67ku,43ku,29ku和14.4ku;S为溶菌酶

(资料来源:汪少芸,2006)

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