王大虎

王大虎:抗真菌活性

绿豆溶菌酶的抗真菌实验结果如图7-28。图中,A为空白对照,在滤纸片上只添加灭菌的0.02mol/L,pH6.0 PBS,B与C分别代表用同样的缓冲液所溶解的不同浓度的溶菌酶的样品(样品溶解后经0.22µm滤膜过滤除菌)。其中B添加溶菌酶为300µg,C添加溶菌酶为60µg。根据有抑菌活性就会在纸片附近形成一个月牙形的抑菌圈的判断标准,因此,我们发现所实验的真菌菌种中,绿豆溶菌酶对其中的6种真菌具有很明显的抑菌活性,即图7-28中的(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)所示。它们所代表的植物致病菌分别为:菜豆根腐病菌(Fusarium solani)、棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、瓜果腐霉病菌(Pythium aphanidermatum)、水稻白绢病菌(Sclerotium rolfsii)、立枯丝核菌(Rhizoctonisolani)和葡萄灰霉病菌(Botrytis cinerea)。

从图7-28还可看出,B处(添加300µg溶菌酶)的抑菌圈明显大于C(添加60µg溶菌酶)处。由此可见,随着浓度的提高,溶菌酶抑菌的效果更加显著,因而表现出浓度的依赖性。

 

图7-28 绿豆溶菌酶抗真菌活性的抑菌图

(资料来源:汪少芸,2006)

以受试真菌菜豆根腐病菌为例,测定了其IC50值。于PDA培养基充分冷却的4个添加不同量溶菌酶的灭菌小培养皿中心处分别点加少量真菌菌丝,28℃恒温培养,直到作为空白对照的菌丝长满培养皿,即得溶菌酶抗真菌活性的IC50抑菌图(图7-29),分别测量不同蛋白质浓度下的菌丝生长半径,计算受抑制率(为受抑制半径与空白对照半径的比值),以蛋白质浓度为横坐标,受抑制率为纵坐标,拟合曲线如图7-30所示。由上拟合曲线图很容易得出,此绿豆溶菌酶对植物致病菌菜豆根腐病菌的IC50值为11µmol/L。

 

图7-29 绿豆溶菌酶抗真菌活性的IC50抑菌图

上图表示溶菌酶所抑制的真菌为菜豆根腐病菌。图中A为空白对照,添加灭菌的0.02mol/L,pH6.0PBS 8µL;B、C和D表示分别添加了12.5µmol/L,50µmol/L和70µmol/L的溶菌酶样品。

(资料来源:汪少芸,2006)

 

图7-30 绿豆溶菌酶抗真菌活性的IC50曲线图

(资料来源:汪少芸,2006)

6.抗细菌活力

溶菌酶以能破坏革兰阳性菌细胞壁的肽聚糖支架,在内部渗透压的作用下细胞胀裂开,引起细菌裂解而著称。有些革兰阴性菌,如埃希大肠杆菌、伤寒沙门菌,也会受到溶菌酶的破坏。因此,为了考察溶菌酶是否是一种具有广谱抑菌作用的植物抗菌蛋白,我们选择了金黄色葡萄球菌(S. aureus)作为革兰阳性菌的代表和伤寒沙门菌(S. typhi)革兰阴性菌的代表菌,采用琼脂纸片扩散法测定溶菌酶对这些细菌病原菌的抑制作用。

结果显示,绿豆溶菌酶对革兰阴性菌伤寒沙门菌没有抑制作用。对病原细菌金黄色葡萄球菌具有明显的抑制作用。我们采用两倍法将溶菌酶稀释成不同浓度以测定其对金黄色葡萄球菌最低抑菌浓度(MIC)。结果如表7-4显示,其MIC值为0.27µmol/L。

表7-4 不同浓度的溶菌酶对金黄色葡萄球菌抑制效果

王大虎
王大虎

注:“-”为阴性结果,“+”为阳性结果。

7.绿豆溶菌酶的新特性

相对溶菌酶能破坏革兰阳性菌引起细菌裂解而言,人们对其抑制植物致病菌的报道比较少。资料显示动物来源的溶菌酶对少数真菌烟草疫霉菌(Phytophthora nicotianaae)和尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum),腐霉菌(Pythium aphanidermstum)和葡萄孢菌(Botrytis cinerea),但并没有详细的报道及量化数据。绿豆溶菌酶在对病原细菌金黄色葡萄球菌有抑制效果的同时,对植物致病菌尖孢镰刀菌,菜豆根腐病菌,X菌(S. rolfsii),腐霉菌表现出较强的抑制活性。而且,以菜豆根腐病菌为例,测试并计算出其IC50值为11µmol/L。

绿豆溶菌酶的活力赋予它崭新的意义。溶菌酶作为一种天然蛋白质,能在胃肠内作为营养物质被消化和吸收,对人体无毒性,也不会在体内残留,是一种安全性很高的的食品保鲜剂、营养保健品和药品。溶菌酶可用于各种加工食品或饮料制作中,集药理、保健和防腐三种功能于一体。因此,在倡导绿色食品的今天,可以想象溶菌酶的应用前景是相当广阔的。而且绿豆溶菌酶在兼具抗细菌抗真菌方面将具有其他溶菌酶所无法比拟的优势,其独特的、未见报道的强抗植物致病菌活性,在农业生产的防植物病虫害上有望结合基因工程、蛋白质工程而得到实际应用。

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