王大虎

王大虎:溶菌酶酶活的测定

 

王大虎 一、重组蛋白包涵体

 

细胞表达外源基因,尤其是以大肠杆菌为宿主菌高效表达外源基因时,表达蛋白常常在细胞质内聚集,形成无活性的固体颗粒,即为包涵体(inclusion body)。当重组蛋白以包涵体形式存在时,可获得高表达、高纯度的重组蛋白,避免蛋白酶对外源蛋白的降解,但不具有生物活性。

包涵体形成了由膜包裹的高密度、不溶性蛋白质颗粒,在显微镜下观察时为高折射区,与胞质中其他成分有明显区别。包涵体形成是比较复杂的,与胞质内蛋白质生成速率有关,新生成的多肽浓度较高,无充足的时间进行折叠,从而形成非结晶、无定形的蛋白质的聚集体;此外,包涵体的形成还被认为与宿主菌的培养条件,如培养基成分、温度、pH、离子强度等因素有关。包涵体一般含有50%以上的重组蛋白,其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等,环状或缺口的质粒DNA,以及脂质体、脂多糖等,大小为0.5~1µm,具有很高的密度(约1.3mg/mL),无定形,呈非水溶性,只溶于变性剂(如尿素、盐酸胍等)。核磁共振等新技术的应用表明,包涵体具有一定量的二级结构,他们可能在复性的启动阶段中具有一定的作用。以包涵体形式存在的蛋白质分子是非折叠状态的聚集体,不具有正确的天然三维结构,表达蛋白不具有生物活性,因此需要获得具有生物学活性的蛋白质必须将包涵体溶解,释放出其中的蛋白质,并通过复性操作以得到具有预期生物活性的蛋白质。细胞中的生物学活性蛋白质常以可溶性或分子复合物的形式存在,功能性的蛋白质总是折叠成特定的三维结构型。

王大虎
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王大虎  二、重组蛋白包涵体的生物学意义

 

蛋白质是生物体内一切功能的执行者,具有完整一级结构的多肽或蛋白质,只有当其折叠形成正确的三维空间结构才可能具有正常的生物学功能,如果这些生物大分子的折叠在体内发生了故障,形成错误的空间结构如包涵体,不但将丧失其生物学功能,甚至会引起疾病,如包涵体肌肉病、包涵体肝炎、淀粉样变X、沙眼等,这些疾病都与包涵体的形成有着密切关系。

此外,在分子生物学和基因工程研究中,形成的包涵体蛋白质的复性率一般都很低,这大大增加了基因工程蛋白质产物的成本。然而,包涵体虽然由无活性的蛋白组成,但对于重组蛋白的生产也提供了几个优势:

①包涵体具有高密度,对机械搅拌和超声破碎不敏感,不易于破壁、分离;

②降低外源蛋白质的浓度,利于高表达;

③重组蛋白以包涵体的形式存在,有效地抵御了大肠杆菌中的蛋白酶对目的蛋白的降解;

④对于生产那些处于天然构象时对宿主细胞有毒害的蛋白质而言,形成包涵体无疑是最佳选择。

重组蛋白的高效表达是首要目的,许多研究采取各种措施使得在表达重组蛋白过程中,尽量避免包涵体形成,如在基因上共同表达融合伴侣,提高重组蛋白的溶解性,促进正确折叠,限制蛋白酶解和利于纯化。似乎这有利于后期分离纯化,但不能忽视外源蛋白质在溶解状态下对宿主菌的不良影响,毕竟外源蛋白质对宿主菌的代谢过程没有贡献,反而可能抑制其正常代谢,阻碍重组蛋白表达的进一步提高,这还有待于进一步的研究。

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