王大虎

王大虎:重组蛋白包涵体的纯化

重组蛋白包涵体的分离纯化,其纯化的方法都与传统的生物大分子分离方式相似。包涵体的分离纯化也是利用其物理和化学性质的差异,即以分子的大小、形状、溶解度、等电点、亲疏水性以及与其他分子的亲和性等性质建立起来的。

王大虎  (一)包涵体提取

1.破菌

基因工程菌发酵液,经离心浓缩后,可用机械破碎、超声破碎、单纯超声破碎,在小规模且菌量较少的情况下效果较好,由于能量传递和局部产热等原因,很难用于大体积细胞悬液的破碎,这样部分未破碎细胞与包涵体混在一起,给后期纯化带来困难。因此,在较大规模纯化时先用溶菌酶破碎细菌的细胞膜,再结合超声破碎方法,可显著提高包涵体的纯度和回收率。

2.洗涤

为了除去包涵体上黏附的杂质,如膜蛋白或核酸,应用洗涤液洗涤包涵体,通常用低浓度的变性剂,过高浓度的尿素或盐酸胍会使包涵体溶解。此外可以用温和去垢剂曲拉通X-100洗涤去除膜碎片和膜蛋白。

3.溶解

一般用强的变性剂如尿素(6~8mol/L)、盐酸胍(6mol/L),强碱通过离子间的相互作用,打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键,使多肽伸展,一般来讲,盐酸胍优于尿素,因为盐酸胍是较尿素强的变性剂,它能使尿素不能溶解的包涵体溶解,而且尿素分解的异氰酸盐能导致多肽链的X氨基甲酰化,特别是在碱性pH下长期保温时。或用去垢剂,如SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物等,可以破坏蛋白质内的疏水键,也可溶解一些包涵体蛋白质。

另外,对于含有半胱氨酸的蛋白质,分离的包涵体中通常含有一些链间形成的二硫键和链内的非活性二硫键。还需加入还原剂,如β-巯基乙醇、DTT、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸。还原剂的使用浓度一般是50~100mmol/L的β-巯基乙醇或DTT。在较粗放的条件下,还原剂的使用浓度与蛋白质二硫键的数目无关,而有些没有二硫键的蛋白质加不加还原剂无影响,如牛生长激素包涵体的增溶。对于某些不含二硫键的目标蛋白质包涵体的增溶,有时还原剂的使用也是必要的,可能由于含二硫键的杂蛋白影响了包涵体的溶解。

王大虎  (二)包涵体复性

由于包涵体中的重组蛋白缺乏生物学活性,加上剧烈的处理条件,使蛋白质的高级结构破坏,因此重组蛋白的复性特别必要。通过缓慢去除变性剂使目标蛋白质从变性的完全伸展状态恢复到正常的折叠结构,同时去除还原剂使二硫键正常形成。一般在尿素浓度4mol/L左右时复性过程开始,到2mol/L左右时结束。对于盐酸胍而言,可以从4mol/L开始,到1.5mol/L时复性过程已经结束。

蛋白质折叠复性的一般原则:包涵体蛋白质折叠复性的效率实际上取决于正确折叠过程与聚集过程的竞争。复性时最好使蛋白质达到一定的纯度。为减少聚集,蛋白质的浓度应很低,一般在10~100g/L较好。复性应尽量不采用突然改变变性剂浓度的办法,因为这样会导致折叠中间体的聚集。不同蛋白质应采用不同的变性剂去除速率。

1.稀释复性

直接加入水或缓冲液,放置过夜,缺点是体积增加较大,变性剂稀释速度太快,不易控制。目前稀释法主要有一次稀释、分段稀释和连续稀释三种方式。

王大虎
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2.透析复性

好处是不增加体积,通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度,有人称易形成无活性蛋白质聚体,且不适合大规模操作,无法应用到生产规模。

3.超滤复性

在生产中较多的使用,规模较大,易于对变性剂去除速度进行控制,缺点是不适合样品量较少的情况,且有些蛋白质可能在超滤过程中不可逆的变性。

王大虎 4.色谱柱复性

主要有两类:一类是吸附型色谱复性,如离子交换色谱、疏水色谱、亲和色谱、扩张床色谱等,基本复性原理是柱平衡后,将变性蛋白质上样并吸附在凝胶介质上,然后用清洗缓冲液洗掉未吸附的变性剂和杂蛋白,最后用复性缓冲液将吸附的蛋白质洗脱下来,在洗脱过程中完成复性。另一类是凝胶过滤色谱复性。

相比稀释和透析两种方法,色谱柱复性收率高(高达90%以上)、快速、易放大,样品稀释倍数小(一般5倍左右)。下面详细介绍色谱柱复性的具体方法和特点。

(1)IEC复性 由于变性蛋白质与固定相之间所带电荷不同,使得变性蛋白质吸附于固定相表面,这可以避免复性过程中蛋白质的聚集作用。在用复性液洗脱的过程中,变性蛋白质进行吸附-解吸附-再吸附的复性过程。IEC含盐的缓冲流动相系统十分类似于蛋白质稳定存在的生理液条件,有利于增加其活性回收率。其固定相基体主要是亲水共聚物。

例如,将DEAE-纤维素卷成柱状装入层析柱中,使用等浓度洗脱,对重组白细胞分泌抑制因子成功地进行了复性和纯化,与传统的稀释法相比其蛋白质浓度提高了6.4倍,且46%的蛋白质可以获得复性,质量收率为96%,而时间只用了5min。

(2)HIC复性 这是基于蛋白质与介质的疏水性相互结合,实现蛋白质与极性变性剂的分离而促使蛋白质复性的方法。当变性蛋白质、变性剂和杂蛋白进入HIC柱后,变性蛋白质被固定相吸附的同时除去以水合状态附着在蛋白质表面和固定相表面接触区域的水分子,使水化的变性蛋白质瞬间失水,并形成局部疏水环境以利于蛋白质分子形成疏水核,并从疏水核开始折叠。随着流动相的不断变化,变性蛋白质逐渐被复性,最后被洗脱液洗脱下来。一些结合力强的修饰试剂添加到复性缓冲液中可降低疏水相互作用并促进复性。添加剂可对天然的、变性的或处于中间态的蛋白质的溶解性和稳定性产生影响。与其他的色谱复性法相比,HIC的固定相促进变性蛋白质疏水核心的形成,所以HIC比其他色谱法更利于复性,并获得较高的活性回收率。

例如,HIC对重组人干扰素-γ(rhIFN-γ)和rhIFN-α分别在复性的同时进行了纯化。rhIFN-γ的盐酸胍提取液在40min内使用一次层析过程就可以使其纯度达到85%,活性收率为稀释法的2~3倍。

(3)亲和色谱复性 亲和色谱复性是利用固定相中的配体与目标蛋白质之间特异性的吸附作用,使得目的蛋白可以保留在固定相中,蛋白质与变性剂分离,而后在洗脱过程中进行复性。依其亲和色谱柱端基的不同,可将其分为:固定化金属亲和色谱、分子伴侣亲和色谱和脂质体亲和色谱。由于配体与目的蛋白间的作用特异性强,而且不同配体与蛋白质间的作用差别较大,所以亲和色谱作为蛋白质复性的机理比较复杂。

①固定化金属离子螯合色谱:金属螯合色谱复性主要是针对具有组氨酸标签的基因工程蛋白质。目前最常用的亲和色谱复性柱为Ni2+亲和色谱柱。这种固定化金属亲和色谱柱的端基可以与末端标记有组氨酸的蛋白质分子有特异的亲和作用,蛋白被结合在色谱柱上,避免了分子间的疏水作用,具有分子伴侣的功能。多聚His标签与固定化的二价金属离子甚至在高浓度变性剂存在下,仍可形成高亲和力复合物,利于标签蛋白的分离和复性。

②分子伴侣亲和色谱:分子伴侣亲和色谱介导蛋白质的复性同它在溶液中的作用一致,与HIC有相似之处。分子伴侣在复性蛋白质时,为变性的蛋白质提供一个疏水性的中空环状疏水腔,当变性蛋白质进入空腔后,可部分避免或完全消除变性蛋白质分子间的相互聚集作用,使蛋白质在疏水环境下进行“结合—释放—再结合”的循环过程,直到其恢复到天然的构象状态。一些分子伴侣如:Gro EL和Gro ES对复性的促进作用也与亲和作用复性相类似。将分子伴侣固定化在凝胶介质上,避免了在溶液中直接添加分子伴侣所产生的后期纯化问题和无法回收所带来的高成本。

例如,将分子伴侣/DSвA/PPI-琼脂糖键合到填料上,合成一种三组分的亲和色谱介质,将其用于还原变性的蝎子毒素Cn5的复性,其质量收率为87%,活性收率达到100%。

③脂质体亲和色谱:根据脂质体可以帮助溶液中的蛋白质复性的特点,可以将脂质体作为配体共价结合到色谱介质上。脂质体可作为一种双水相系统,有人工分子伴侣的功能。它对不同浓度变性剂变性的具有不同分子构象的蛋白质有高度的选择性,而不同分子构象的蛋白质在柱子上的存留与局部疏水性相关。在蛋白质复性过程中,脂质体色谱柱能够键合蛋白折叠中间体,抑制其发生分子间的聚集反应,从而提高活性产量。

(4)扩张床吸附复性 该技术是利用扩张床吸附色谱直接从细菌裂解变性液中捕获并复性目标蛋白质。其过程是将细菌破碎液直接加入高浓度的变性剂,然后上样到扩张好的柱床上。在上样过程中,细胞碎片和不吸附的杂质流穿掉,而变性蛋白被吸附在凝胶上,然后用含变性剂的缓冲液清洗掉剩余杂质,再用不含变性剂的缓冲液洗掉变性剂,将扩张床沉降后,用洗脱缓冲液将目标蛋白质洗脱下来,而通过吸附、清洗和洗脱的过程,变性蛋白质得以复性并获得初步纯化,这一技术节省了细菌破碎液的澄清过程,将澄清、捕获、纯化、复性结合为一体,是很有潜力的纯化和复性技术。

(5)凝胶过滤色谱复性 凝胶过滤色谱复性又称体积排阻复性,是一种广泛应用的色谱技术。1994年,美国科学家M. H. Werner等首次实现了用凝胶过滤对大肠杆菌RNA酶A,rhETS-1和硫氰酸酶的复性。与常用的稀释复性法相比,凝胶过滤色谱复性能在高的起始蛋白质浓度下对蛋白质进行复性,活性回收率较高,同时又能使目标蛋白质得到一定程度的纯化。凝胶过滤复性时,除了蛋白质在胶粒中的传质和扩散外,蛋白质与介质之间并不发生其他任何作用,复性过程始终发生在溶液中。蛋白质在伸展状态中,每个蛋白质分子的伸展状态都会有差别,而不同伸展状态的蛋白质分子在凝胶颗粒内部扩散所受到的限制也不相同,有的会扩散入颗粒内部深一些,有的会浅一些,这使不同伸展状态的蛋白质分子达到一定程度的分离,这样蛋白质分子间相互作用的机会就大大减少,从而起到一定抑制凝集的作用;即使发生了部分凝集,凝集的蛋白质会附着在胶粒上,而不随着溶液向下运动,这样后面的变性剂可以赶上凝集的蛋白质,使其重新溶解并变性;并且在凝胶过滤中脲等变性剂脱除得相对较慢,这对有些蛋白质的复性是有利的。在普通凝胶过滤中,变性剂和还原剂的脱除虽较稀释复性慢,但变性蛋白质仍会经历变性剂浓度突然变化的过程。

为了克服这一缺陷,采用脲梯度凝胶过滤复性可以获得很好的效果。脲梯度复性是样品上柱前用复性缓冲液平衡柱子,接着使变性剂浓度递减(如从6mol/L盐酸胍或8mol/L尿素下降到复性缓冲液中预先确定的变性剂的浓度)。此法为蛋白质复性提供了一个较温和的环境,实现了线性去除变性剂,对高浓度变性蛋白质的复性效果十分显著。对初始浓度为17mg/mL的还原变性溶菌酶,在40min内可以得到高达90%的活性收率。此外他们在脲梯度凝胶过滤的基础上发展了pH和脲浓度双梯度凝胶过滤法用于蛋白质复性,效果很好。

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