大虎说事

王大虎:高蛋白质浓度下的复性

通常有两种方法,一是缓慢地连续或不连续地将变性蛋白质加入到复性缓冲液中,使得蛋白质在加入过程中或加入阶段之间有足够的时间进行折叠复性;二是采用温度跳跃式复性,即让蛋白质先在低温下折叠复性,以减少蛋白质聚集的形成,当形成聚集体的中间体已经减少时,迅速提高温度以促进蛋白质折叠复性。此外,吸附法、反胶束法和双水相萃取法等都可用作蛋白质的复性。

6.影响复性效率的因素

影响复性效率的因素有很多,主要包括:

①蛋白质的复性浓度:正确折叠的蛋白质的得率低通常是由于多肽链之间的聚集作用,蛋白质的浓度是使蛋白质聚集的主要因素,因而,一般浓度控制在0.1~1mg/mL;如果变性蛋白质加入复性液中过快,容易形成絮状沉淀,可能是蛋白质重新凝聚的缘故。所以我们采用在水浴和磁力搅拌下,逐滴加入变性蛋白质,使变性蛋白质在复性液中始终处于低浓度状态。

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②pH和温度:复性缓冲液的pH必须在7.0以上,这样可以防止X硫醇的质子化作用,影响正确配对的二硫键的形成,过高或过低会降低复性效率,最适宜的复性pH一般是8.0~9.0。

此外,影响复性效率的因素还有变性剂的起始浓度和去除速度、氧化还原电势、离子强度、共溶剂和其他添加剂的存在与否等。

(三)重组蛋白包涵体纯化

重组蛋白包涵体的纯化步骤总体包括溶解、复性、色谱等手段,并以SDS-PAGE、蛋白质印迹等进行检测鉴定。这里以大肠杆菌中表达重组麦芽糖结合蛋白MBP-Rep为例,阐述对形成的包涵体进行分离纯化,包括分离、溶解、复性、离子交换、多糖树脂亲和层析。

1.纯化过程

(1)MBP-Rep融合蛋白溶解性分析 收集诱导细胞,溶于1mL,50mmol/L Tris缓冲液,pH分别取8.5、8.0和7.4,其中含100mmol/L NaCl。经超声破碎(300W,总时间2min,脉冲振荡,开5s停5s),溶菌液冰浴30min后,4℃下15000r/min,离心20min,所得上清液、沉淀分别收集。沉淀以1mL相应Tris缓冲液溶解,等量的沉淀溶液与上清液分别走10%SDS-PAGE。

(2)包涵体准备、提取 从1L发酵液中收集诱导细胞,细胞以0.85%盐溶液洗涤2次。将细胞以10mL/mg溶于Tris缓冲液(50mmol/L,pH8.5),超声振荡(300W,每间隔9s振荡9s,5min)。于4℃,8000r/min离心20min。以TTN缓冲液(pH8.5,50mmol/L Tris、100mmol/L NaCl、2%曲拉通X-100)洗涤2次,以TN缓冲液(pH8.5,50mmol/L Tris、100mmol/L NaCl)洗涤1次。

(3)溶解、复性 加Tris-Urea缓冲液(pH8.5,50mmol/L Tris、0.1mol/L NaCl、4mol/L尿素),37℃下静置5h。20℃、15000r/min离心20min,去沉淀,取上清溶液,4℃下加入其10倍体积的复性缓冲液[pH8.5,50mmol/L Tris、0.1mol/L NaCl、10%(体积分数)甘油、0.2%聚氧乙烯月桂醚(C12E9)、Sigma],缓冲液以5mL/h速度加入并缓慢搅拌,搅拌过夜,然后超滤浓缩(Amicon, Millipore)。

(4)IEC 10mL柱填充3mL阴离子交换剂(Q-Sepharose; Sigma-Aldrich Corp.),以平衡缓冲液(pH8.5,50mmol/L Tris、0.1mol/L NaCl、10%甘油和0.2%C12E9)平衡,蛋白液以流速15mL/h上样,再用上述复性缓冲液洗涤,然后以不含去垢剂C12E9的相同缓冲液洗涤,最后以NaCl梯度洗脱(50mmol/L~1mol/L,间隔25mmol/L),不含去垢剂。

(5)多糖树脂亲和色谱(MBP对多糖的亲和作用) 20mL柱装3mL多糖树脂,以平衡缓冲液(pH8.5,25mmol/L Tris-HCl、325mmol/L NaCl、1mmol/L EDTA、1mmol/L PMSF、10%甘油)平衡,将混合的MBP-Rep部分(杂蛋X最少的)上样,以复性缓冲液洗涤(5倍床层体积),然后分别用含200mmol/L、100mmol/L NaCl的缓冲液洗涤。最后用含麦芽糖的洗脱缓冲液(pH8.5,25mmol/L Tris-HCl、100mmol/L NaCl、1mmol/L EDTA、1mmol/L PMSF、10%甘油、10mmol/L麦芽糖)洗脱。

(6)MBP-Rep融合蛋白分析 活性分析实验:26-nt寡核苷酸(5′-GCTATAATATT*ACCTGAGTGCCCCGC-3′)构成Rep蛋白识别位点(*),可与Rep共价结合。二者在22℃下,反应缓冲液(pH7.6,25mmol/L Tris-HCl、300mmol/L NaCl、5mmol/L MnCl2、1mmol/L EDTA、1mmol/L DTT)中反应30min。然后加入2×SDS-PAGE样品缓冲液(10µL),94℃下保温5min。再进行12%SDS-PAGE电泳(50V×15h),以MilliQ水洗3次,加固定液(40%甲醇、10%乙酸),过夜。MilliQ水冲洗3次,用考马斯亮蓝染色3~5h。

对照实验:以不含上述识别序列位点、但等长的寡核苷酸代替。

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