王大虎

王大虎:实验结果与分析

MBP是作为分子伴侣,能提高蛋白质溶解性,帮助折叠,保护重组蛋白Rep免受蛋白酶降解,增强蛋白质稳定性,能减少包涵体形成。据报道成熟MBP蛋白分子质量为40ku,预测目的蛋白MYMIV-Sb[MP]Rep大小为41.2ku,因此融合蛋白MBP-Rep应该是81.2ku,这与IPTG诱导表达结果一致(图7-31)

 

图7-31 蛋白质印迹分析蛋白

A—10%SDS-PAGE;B—Rep抗血清探针做蛋白质印迹

A:1—标样 2—非诱导细胞总蛋白(对照) 3—诱导细胞总蛋白

B:1—非诱导细胞(对照) 2—诱导细胞,以DAB(3,3′-二氨基联苯胺-四盐酸)为底物检测

(资料来源:Girish K. R.,2006)

从图7-31可看出,经诱导表达的细胞总蛋白质中含有很明显的分子质量约80ku的重组蛋白,而对照细胞则没有,另外从其他条带比较,诱导细胞与对照细胞的蛋白质基本一致,只是条带比较淡些,推测是重组蛋白高表达影响到细胞自身正常代谢。

即使在MBP存在下,重组蛋白还是有相当部分形成包涵体,这从图7-32可以看出,因此对包涵体的提取、复性、分离、纯化是必要的。比较pH分别在8.5、8.0、7.4下的溶解性,差别不大,选用pH8.5,在后续分离纯化过程所选用的缓冲液也都设定pH8.5。复性、纯化效果见图7-33所示,可以看出经洗涤后的包涵体蛋白质与细胞总蛋白质有所差别,经折叠复性后蛋白质得到一定纯化,经离子交换后的蛋白质主要有3条带,经亲和色谱后蛋白质只剩80ku一条。

 

图7-32 SDS-PAGE分析融合蛋白MBP-Rep的溶解性

以含100mmol/L NaCl,pH为8.5、8、7.4的Tris缓冲液处理,其中,1—蛋白质标样 2、4、6—沉淀部分 3、5、7—上清液部分

(资料来源:Girish K. R.,2006)

 

王大虎 图7-33 MBP-Rep的复性、纯化

1—蛋白质标样 2—非诱导细胞总蛋白质 3—诱导细胞总蛋白质 4—经缓冲液洗涤后的包涵体样品 5—折叠复性包涵体蛋白质 6—离子交换后蛋白质 7—亲和色谱后蛋白质

对复性纯化后蛋白质的活性鉴定表明,该蛋白能识别含有(5′-GCTATA-ATATT*ACCTGAGT GCCCCGC-3′)特异序列的寡核苷酸,从图7-34中看出多出了一条分子质量较大的带,即MBP-Rep-DNA复合物,证明重组蛋白经正确折叠,有生物活性。

王大虎
王大虎

 

王大虎 图7-34 体外解离检测鉴定MBP-Rep活性

MBP-Rep-DNA复合物以12%SDS-PAGE检测,其中,1—蛋白质标样 2—MBP-Rep 3、4、5—不同加入量的MBP-Rep(分别为0.04、0.08、0.12nmol)与1nmol特异寡核苷酸反应;6—对照实验,MBP-Rep与大小一样但无关寡核苷酸混合 蛋白质-DNA复合物标记为*

(资料来源:Girish K. R.,2006)

另外,以蛋白质印迹分析表明,不论是单独的融合蛋白MBP-Rep,还是MBP-Rep-DNA复合物,都能Rep对应的抗血清产生免疫反应,并在图7-35上显示出来,也同时证明其有效折叠。

 

图7-35 蛋白质印迹分析MBP-Rep-DNA复合物

1—MBP-Rep 2—MBP-Rep和无关寡核苷酸 3、4、5—不同加入量的MBP-Rep(分别为0.04、0.08、0.12nmol)与1nmol特异寡核苷酸反应。以相应抗血清鉴定(Rep蛋白的N末端部分序列MYMIV-Vig)

(资料来源:Girish K. R.,2006)

 

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