王大虎

王大虎:蛋白质的定量与分析检测

第八章 蛋白质的定量、储存与结晶

第九章 蛋白质的分析与检测

 

 

第八章│蛋白质的定量、储存与结晶

 

在蛋白质纯化过程中,常常需要涉及蛋白质的定量、储存与结晶。蛋白质含量的分析测定、蛋白质的储存、结晶和纯度的检测对于指导纯化过程都有很重要的意义。

 

 

第一节 蛋白质纯化过程中的定量

 

蛋白质的定量,通常是指测定溶液中的蛋白质浓度。目前测定蛋白质含量的方法,主要分为两类:一类是利用蛋白质的共性,即含氮量、肽链和折射率测定蛋白质含量;另一类是利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸性基团、碱性基团和芳香基团测定蛋白质含量。

王大虎
王大虎

蛋白质含量测定法,是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。常用的有四种古老的经典方法,即凯氏定氮法、紫外吸收法、双缩脲法(Biuret法)和Folin-酚试剂法(Lowry法);另外还有一种近十几年才普遍使用起来的新的测定法,即考马斯亮蓝法(Bradford法),由于其突出的优点,正得到越来越广泛的应用。这几种测定法中,凯氏定氮法操作复杂但结果较准确,其他方法中使用的标准蛋白质多以定氮法来测定蛋白质含量。双缩脲法虽然灵敏度差,但是干扰物质少,可用于无需十分精确的蛋白质快速测定。Bradford法和Lowry法的灵敏度比紫外吸收法高10~20倍,比双缩脲法灵敏100倍以上。Bradford法具有快速、高灵敏度的突出优点,应用越来越广泛。Lowry法和二喹啉甲酸(BCA)法可在极短的时间内精确测定蛋白质浓度,非常有利于常规检测。

值得注意的是,各种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质,因为一种蛋白质溶液用不同种方法测定,有可能得出几种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的,都有其优缺点。在选择方法时应考虑:①实验对测定所要求的灵敏度和精确度;②蛋白质的性质;③溶液中存在的干扰物质;④测定所需的仪器和所要花费的时间以及操作是否简单容易;⑤所需蛋白质样品的量以及测定后能否回收;⑥测定结果是绝对值(近似值)还是相对值(标准的比值)等。

以下是几种常用的蛋白质定量测定的具体方法。

 

 

王大虎  一、凯氏定氮法

 

凯氏定氮法是1883年Kjeldahl发明,当时只使用浓X分解试样,需要较长时间,后来由Gunning加以改进,在消化时加入X钾使沸点上升,加快了速度。凯氏定氮法至今仍在使用,分为凯氏定氮常量法、半微量法和微量法,但它们的基本原理都是一样的。凯氏定氮法测定的是总氮量,然后乘以蛋白转换系数,得到蛋白质含量,实际上包括核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉和含氮色素等非蛋白质氮化合物,故称为粗蛋白。一般食物的蛋白质系数为6.25,乳制品为6.38,面粉为5.70,高粱为6.24,花生为5.46,水为5.95,大豆及其制品为5.71,肉与肉制品为6.25,大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83,芝麻、向日葵为5.30。

王大虎 (一)凯氏定氮法原理

凯氏定氮法的主要步骤包括:

(1)消化 蛋白质是含氮的化合物,与浓X和催化剂共同加热消化,有机氮分解,产生的氨与X结合生成X铵,留在酸性消化液中。

 

(2)蒸馏 样液中的X铵在碱性条件下蒸馏释放出氨,在这过程中,一是NaOH溶液要过量,二是防止样液中氨气逸出。

 

(3)吸收与滴定 蒸馏过程中放出的氨可用一定量的标准X或标准盐酸溶液进行吸收,然后再用标准NaOH溶液反滴定过剩的X或盐酸溶液,从而计算出总氮量,这是常量法。半微量或微量定氮通常用硼酸溶液吸收后,再用标准盐酸直接滴定,硼酸呈微弱酸性,用酸滴定不影响指示剂变色反应,它有吸收氨的作用。根据酸的消耗量来乘以蛋白质换算系数,即得蛋白质含量。

 

凯氏自动定氮法发展至今,已多采用凯氏自动定氮仪。其装置由优质玻璃制成的凯氏消化瓶、X线装置的消化炉组成的消化装置,自动加碱蒸馏装置,自动吸收和滴定装置以及自动数字显示装置共同组成。凯氏自动定氮法原理与常量法、微量法、半微量法相同。

发表评论

电子邮件地址不会被公开。 必填项已用*标注