王大虎

王大虎:蛋白质提取技术

王大虎  第一节 总提取策略

 

在蛋白质的科研及相关产品生产过程中,蛋白质的分离纯化是关键步骤,而蛋白质的提取是整个纯化过程的第一步,选择恰当的提取方法对后续的纯化过程非常重要。蛋白质种类繁多,一方面因其性质差异大,即使是同类蛋白质,提取原料不同,使用方法差别也很大,且又处于不同的X中,使得蛋白质的提取和分离没有一个固定的程序。但另一方面,多数分离工作中关键部分的基本手段还是共同的,大部分蛋白质均可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中,少数与脂类结合的蛋白质溶于乙醇、丙酮及丁醇等有机溶剂中,这些共性又使得蛋白质提取和分离过程的基本方法是共同的。因此,要根据不同蛋白质样品的性质和所研究的目的来选择和确定分离提取的方法。对于可溶性蛋白质,根据其在不同溶剂中溶解度的差异,选择恰当的溶剂提取。蛋白质在不同溶剂中溶解度的差异,主要取决于蛋白质分子中非极性疏水基团与极性亲水基团的比例,以及这些基团的排列和偶极矩。分子结构性质是不同蛋白质溶解度差异的内因,而温度、pH、离子强度等是影响蛋白质溶解度的外因。需根据这些内外因素对蛋白质进行提取。对于不溶性蛋白质,如角蛋白、胶原及丝蛋白等,则应选用适当的溶剂洗去可溶性的伴随物,如脂类、糖类和其他可溶性蛋白质,然后再用水、稀盐、稀酸及缓冲液等适当溶剂将不溶蛋白质溶解出来。对于以可溶性的形式存在于X中的动物组织蛋白质,如血浆、消化液等,可以直接进行分离而不必经过提取阶段。对于微生物发酵或动植物细胞培养的蛋白质,视其在细胞内外的位置选取不同的提取方法:存在于细胞内的蛋白质,需先破碎细胞,再提取;存在于细胞外的蛋白质,则无需破碎细胞而直接提取。在提取过程中,用适当缓冲液控制提取物的pH,能增加其共稳定性和溶解度。如球蛋白类能溶于稀盐溶液中,脂蛋白可用稀的去垢剂溶液如SDS、洋地黄皂苷溶液或有机溶剂来抽提。其他不溶于水的蛋白质通常用稀碱溶液抽提。总之,对不同来源蛋白质的提取,其最终目的是尽可能多地提取目的蛋白,并保持其活性尽可能少地损失。

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王大虎  一、原料的选择与处理

(一)原料的选择

蛋白质在分离纯化过程中,能否成功提取其有效成分与原材料的选用有密切关系。原料的选择主要依据所提取的目标蛋白质和实验目的而定。从工业生产角度考虑,理想的原料应含量高、来源丰富、稳定性好、成本低、新鲜以及制备工艺简单等。但完全具备以上条件的原料常常无法获得,如含量丰富的材料,来源却困难;或含量、来源均理想,但制备程序复杂,反而不如含量略低些但易获得纯品的材料。例如,提取胰岛素时,牛胰脏中胰岛素的含量比猪胰脏中高,但从来源上看,全国猪的饲养数量较牛多,猪比牛更易获得,因此制备胰岛素首选猪胰脏作为原料。又如磷酸单酯酶的提取,从含量看,其在肝脏、胰脏和脾脏中均较丰富,但因其与磷酸二酯酶共存,很难在分离提取过程中分开,相反虽然前列腺中磷酸单酯酶含量较少,但因前列腺中几乎不含磷酸二酯酶,因此选取前列腺作为提取的原料。从科学研究的角度考虑,则只需满足实验的要求就可以了。此外,还应根据实验目的来决定是否需要考虑种属的影响,如鲣的心肌细胞色素C较马的易结晶,马的血红蛋白较牛的易结晶。若是研究蛋白质自身的性质及结构,原料的来源种属必须是一定的,如研究由于病态引起的特殊蛋白质(如本斯·琼斯氏蛋白、贫血血红蛋白)时,不但采用种属一定的原料,而且原料要取自同一个体。但若是利用蛋白质的活性,则无需考虑原料的种属问题,如利用胰蛋白酶水解蛋白质的活性,用猪或牛胰脏均可。另外,可能的情况下应尽量选用全年均可采到的原料。对动物生理状态间的差异(如饥饿时脂肪和糖类相对减少)、采收期及产地等因素也要注意。

王大虎  (二)原料的处理

选择到合适的原材料后,应首先进行原材料的预处理。不同来源的原材料特点不同,处理的方法和要求也不尽相同。如动物组织要先剔除结缔组织和脂肪组织等非活性部位和一些易于除去的无需物质;植物种子要去壳、除脂等;微生物来源的要通过离心将发酵液和菌体分离开,并视目标蛋白质存在于细胞内外的位置决定是否需要破碎细胞。获取原材料后,最好立即使用,否则所需的目标蛋白质会部分甚至全部被破坏,影响提取效率。例如,从猪肠X提取肝素时,新鲜材料每千克小肠可得肝素钠5万~6万单位;但将材料置于25℃以上的室温存放约1h后,肝素钠的含量会显著下降。其原因是,猪小肠内大量的微生物(2.5~3×108个/g)不停地繁殖(如大肠杆菌约每20min繁殖一次),有的会产生降解肝素钠的酶系。若原材料不能立即使用,一般应采用冰冻或干燥等方法处理。

 

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