王大虎

王大虎:细胞的破碎

在蛋白质的提取分离过程中,常常遇到目标蛋白质存在于细胞内的情况,需要破碎细胞。事实上,除了提取细胞外成分,对细胞内及多细胞生物组织中蛋白质的分离提取均需先将细胞破碎,使其充分释放到溶液中。不同的生物体或同一生物体不同的组织,其细胞破碎难易不一,使用方法也不完全相同。如动物胰、肝、脑组织一般较柔软,用普通匀浆器磨研即可;肌肉及心组织较韧,需预先绞碎再制成匀浆。破碎方法的选择取决于破碎的对象和目的,既要考虑细胞的生理活性状态对细胞破碎的影响,又要考虑其他蛋白质或蛋白酶对目的蛋白的污染和降解,以及目的蛋白的活性。细胞破碎过程中常会产生较多的热量,应尽量保持低温,并将样品预先冷却。细胞破碎后,为防止释放的蛋白酶对目的蛋白的降解作用,最好尽快提取,也可以通过加入抑制剂或降温来减少蛋白酶的作用。常用的细胞破碎方法主要有机械破碎法、物理破碎法、化学破碎法和酶促破碎法等。在实验过程中,既可单独使用一种破碎方法,也可多种破碎方法联合使用,并控制好操作条件,以达到较好的破碎效果。

王大虎  (一)机械破碎法

机械破碎法是指利用机械运动所产生的剪切力的作用使组织细胞破坏,可以分为研磨和组织捣碎两种方法。常用的细胞破碎器械有组织捣碎机、匀浆器、研钵和研磨、压榨器等。

1.研磨

研磨是将剪碎的动物组织置于研钵和匀浆器中,用研磨棒研碎。适用于较软的组织,如肝、肾和脑组织等。常用的研磨器械有研钵、细菌磨、匀浆器。为了提高研磨效果,可加入一定量的石英砂(45~50目),但要注意其对目的蛋白的吸附作用。此法较温和,适宜实验室应用。大规模生产时,可用电动研磨法。

(1)研钵 研钵多用于研磨细菌或其他坚硬植物材料,研磨时常加入少量石英砂、玻璃粉或其他研磨剂,以提高研磨效果。加入石英砂时,要注意其对目的蛋白的吸收。

(2)细菌磨 细菌磨是一种改良的研磨器,比研钵具有更大的研磨面积,而且底部有出口。操作时先把细菌和研磨粉调成糊状,每次加入一小勺,研磨20~30s即可将细菌细胞完全磨碎。

(3)匀浆器 利用匀浆器产生的剪切力破碎组织细胞,先将剪碎的组织置于管中,再套入研杆来回研磨,上下移动,即可将细胞研碎。此法细胞的破碎程度比高速组织捣碎机高,对酶活力的影响也不大,适用于破碎量少和动物脏器组织。

王大虎 2.组织捣碎法

组织捣碎法是利用捣碎机的高速旋转叶片所产生的剪切力破碎组织细胞,是一种较剧烈的破碎细胞方法,适用于肌肉等较坚韧的组织及植物种子、叶芽等比较脆嫩的组织。通常先用家用食品加工机将组织打碎,然后再用10000~20000r/min的内刀式组织捣碎机(即高速分散器)将组织的细胞打碎。在捣碎期间必须保持低温,以防止温度升高引起目的蛋白变性,因此捣碎的时间不宜太长。

(二)物理破碎法

物理破碎法是通过各种物理因素(如温度、压力、声波等)的作用,使组织细胞破碎。此法多用于微生物细胞的破碎。

1.反复冻溶法

将待破碎的细胞在-20℃以下冰冻,室温融解,反复多次进行,由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀,使细胞结构破碎。此法适用于细胞壁较脆弱易破的微生物菌体,但会存在破碎率较低的问题。

王大虎  2.急热骤冷法

将材料投入沸水中,维持85~90min,再置水浴中急速冷却。此法适用于细菌及病毒材料。

3.压力差破碎法

压力差破碎法即通过压力的突然变化使细胞破碎的方法,常用的有高压冲击法、突然降压法、渗透压变化法等。高压冲击法是在结实的容器中装入细胞和冰晶、石英砂等混合物,然后用X或冲击锤施以高压冲击,冲击力可达50~500MPa,使细胞破碎。突然降压法是将细胞悬浮液装入高压容器,加压到30MPa甚至更高,打开出口阀门,使细胞悬浮液迅速流出,出口处的压力突然降低到常压,细胞迅速X而破碎。渗透压变化法是利用渗透压的变化使细胞破碎,即将待破碎的细胞先置于高渗溶液中平衡一段时间,再转入4℃左右的水中或其他低渗溶液中,因细胞内外的渗透压变化而使细胞破碎。

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王大虎  4.超声波处理

超声波处理即利用超声波发生器所发出的声波或超声波作用,使细胞膜产生空穴作用而破碎细胞,可利用15~25kHz频率的超声波进行细胞破碎。该法在处理少量样品时,具有操作简便、效率高、液量损失少等特点,适于实验室使用,但不适于大规模的细胞破碎。若在细胞悬浮液中加入石英砂可破碎缩短时间。常采用间歇处理和降低温度的方法进行破碎,以防止电器长时间运转产生过多的热量导致目的蛋白失活和变性。

(三)化学破碎法

化学破碎法是通过各种化学试剂对细胞膜的作用使细胞破碎的方法。如有机溶剂(甲苯、丙酮、氯仿等)可以破坏细胞膜的磷脂双分子层,从而改变细胞膜的通透性,使胞内物质释放到胞外。而表面活性剂(曲拉通、吐温等)可和细胞膜中的磷脂及脂蛋白相互作用,破坏细胞膜结构,从而增加细胞膜的通透性。

(四)酶促破碎法

王大虎  1.自溶法

自溶法是在一定pH和适当的温度下,利用组织细胞内自身的酶系统将细胞破碎的方法。此过程需较长时间,常用少量防腐剂如甲苯、氯仿等防止细胞的污染。值得注意的是,此法酶系统中的有些酶也可能将目的蛋白降解。

2.酶溶法

酶溶法是根据细胞外层结构的特点,外加适当的酶(如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶、半纤维素酶、脂酶等)将细胞壁分解,使细胞内含物释放出来。有些细菌对溶菌酶不敏感,加入少量巯基试剂或8mol/L尿素处理后,使细菌变为对溶菌酶敏感而溶解。

 

 

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