王大虎

王大虎:细胞器的分离

制备某种生物大分子时,往往需要采用细胞中某一部分为材料;或者为了纯化某一特定细胞器上的生物大分子,通常破碎细胞后,先分离各组分,以防干扰,这对制备一些高难度和高纯度的生物大分子是必要的。细胞器的分离一般采用差速离心法和密度梯度离心法。

王大虎(一)差速离心

差速离心是在密度均一的介质中,由低速到高速逐级离心,使各种沉降系数不同的颗粒先后沉淀下来,达到分离目的的分离方法,如图2-1所示。此法适用于分离大小、形状相差较大的组分,即沉降系数差别在一个或几个数量级的颗粒。此法较简单,离心时,根据不同样品,选择好转速和时间,待沉降系数大的组分沉淀下来后,让上清液再在更高的转速下离心以沉淀沉降系数小的颗粒。

 

图2-1 差速离心分离

在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为:细胞核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高尔基体,最后为X白体。由于各种细胞器在大小和密度上相互重叠,而且某些慢沉降颗粒常常被快沉降颗粒裹到沉淀块中,一般重复2~3次效果会好一些。差速离心只用于分离密度和大小悬殊的细胞,更多用于分离细胞器。对于精细的分离,则是密度梯度离心效果更好。

王大虎(二)密度梯度离心

密度梯度离心是指用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度,将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部,通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。此法具有分辨力好、抗对流强、样品稳定等优点,如图2-2所示。

 

图2-2 密度梯度离心

根据原理的不同,密度梯度离心可分为速度区带离心和等密度离心。

1.速度区带离心

速度区带离心是把样品铺放在一个连续的或不连续的液体密度梯度中,用此梯度液作为颗粒沉降的介质。颗粒的沉降速度取决于其大小、形状、密度,也取决于离心力以及介质的密度和黏度,所以沉降系数相差为20%或差别更小的颗粒可以用这一方法毫不困难地分离。可以说,速度区带离心法在一次离心过程中实现了几次多级差速离心的过程,扩大了差速离心法的分离范围。

对于形成梯度的材料,其要求是:所形成的溶液密度应包括所需要的密度范围(样品溶液的密度应比梯度顶端的密度小,样品颗粒的密度应比梯度底端的密度小);所形成的溶液的黏度要低,对离子强度及pH所产生的影响应最小;对生物样品应具有惰性,即不会发生化学反应;在溶液中无水合作用,无表面活性,不与质点发生化学作用,不影响光学监测数据的测定;离心后易分离除去,不妨碍分析等。经常使用的梯度材料有蔗糖、甘油及盐类(如氯化铯、氯化铷)等。

进行速度区带离心时,温度要控制好,一般以不使样品失活为宜。另外,样品的温度与梯度的温度要相同,否则由于温度差会引起对流而使样品扩散。同时,样品溶液、梯度溶液的温度与离心时的温度也要相同,通常采取冷冻离心机。离心时所选用的时间及速度极为重要,不要使用过长的时间或过高的转速,以免样品失活。

速度区带离心主要用于分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。它可以分离从细胞到各种大分子颗粒的组分,因此,分离制备所需要的离心条件也极不一样。

王大虎 2.等密度离心

王大虎
王大虎

等密度离心与分离颗粒的大小无关,而与它们的密度有关,它是一种测定生物物质颗粒的浮力密度的静力学方法。离心开始前,把样品加在密度梯度溶液的上层或均匀分布在梯度溶液中,梯度可预先制备或让其在离心时自然形成。离心后,离心管底部的密度大于生物物质的密度,而上部的密度则小于它,生物物质向着离心管内部梯度中相当于其本身浮力密度的某个位置移动,最终达到与自己密度相同的液体层次处,再离心也不再有密度的变化(这也是等密度离心与速度区带离心的区别之一),每种生物物质形成一条狭窄的带。

等密度离心中,经常使用的梯度材料是氯化铯,因为氯化铯溶液在离心力场(通常为超速离心力)作用下能形成一连续的密度梯度。实际上,通常所指的等密度离心就是指氯化铯密度梯度离心。

(三)过滤

在经过离心操作后,样品一般还需过滤才能进入下一个阶段,过滤是为了除去蛋白质样品溶液中细小的颗粒。在实验室内,通常先用滤纸过滤,再进行膜过滤,一般选用孔径为0.2µm和0.45µm的塑料膜。过滤操作可以在常压或减压状态下进行。

膜过滤可以除去细胞和细胞碎片,分离效率高,流速高,所需时间短,处理量大,设备可靠,简单。膜的材料有聚丙烯、醋酸纤维和硝酸纤维等。对于几毫升的少量样品,可以选用Gelman Laboratory的0.45µm注射型膜过滤器,非常方便。

影响膜过滤的因素主要有:压力差、颗粒浓度和操作温度。膜两侧的压力差最好保持在较小且可以提供足够的驱动力水平,以保证流量在合适的范围内,压力差增加,流量也增加。但是超过一定的压力差,流量就不会增加了,过高的压力差反而会降低流量。进料中固体浓度增加会导致流量的下降。升高操作温度可以降低溶液的黏度,从而提高流量,但是从蛋白质纯化的总体来考虑,还是在低温(4℃)下进行膜过滤比较合适。

为了能够重复使用膜或在长时间操作过程中保证高的流量,需要定时清洗膜,具体有物理方法、化学方法、生物方法等。物理方法有水洗、反冲、超声波处理等,无机膜可以用热处理。许多化学试剂可以用于清洗膜,如0.1mol/L NaOH溶液、1~2mol/L NaCl溶液、0.1mol/L HCl溶液、0.25%~0.3%HNO3溶液或1%胰蛋白酶溶液等。需要注意膜生产厂家对清洗试剂的要求。

 

 

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