王大虎

王大虎:蛋白质提取时的保护性措施

影响蛋白质水解变性的因素有外在因素和内在因素两方面,外在影响因素主要包括细胞破碎方式、缓冲液pH、温度、离子强度、还原剂和金属离子等;而内在影响因素主要是蛋白水解酶的问题,提取过程中要注意采取一定的保护措施。

一般理想的提取溶液应具备下述条件:对有效成分溶解度大,破坏作用小;对杂质不溶解或者溶解度很小;来源广泛、价格低廉、操作安全等。以下是提取有效成分的影响因素及相应的保护性措施。

王大虎 (一)外在影响因素及预防措施

1.细胞破碎方式

破碎组织有多种方法,但应选择那种能使所需蛋白质获得高产率而又无明显变性的方法。机械组织匀浆器或搅切器对于破碎组织和制备组织匀浆是极有用的,这些机器的主要不足是有可能产生泡沫。当水溶液中的蛋白质在空气与水界面处形成薄膜时会产生气泡和泡沫,在这些界面形成的表面上蛋白质可能会变性,因此要避免起泡沫以得到有活性的蛋白质。此外,细胞破碎后,要降低温度,尽快萃取,避免氧化、吸附和污染。

王大虎  2.缓冲液的pH

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如第一章所述,提取缓冲液的pH是一个关键性参数,应一开始就确定最适pH。酸性蛋白如钙调蛋白,在pH高于中性的条件下很容易溶解;碱性蛋白在酸性pH条件下较易溶解;具有中性等电点(pI)的蛋白质在高于或低于pI的pH条件下很容易溶解。一般说来,提取蛋白质时应在远离其pI的pH条件下进行,以不危及蛋白质的化学属性。避开极端pH条件是个好主意,因为在此种条件下有可能发生蛋白质结构的化学变化。当缓冲液pH达到9.0以上时,可能发生谷氨酰胺和天冬酰胺侧链的脱酰胺作用,结果使蛋白质含有不正常数目的谷氨酸和天冬氨酸残基,从而改变其pI。高pH条件下,肽键也会发生部分水解,某些修饰组分也会降解。在温和的酸性(pH4.0~6.0)条件下,蛋白质在化学上是相当稳定的。不过,极低的pH条件会使某些蛋白质变性和沉淀,导致生物活性的丧失。

选择缓冲液时,首要考虑的是能覆盖所需pH的有效缓冲范围。除缓冲液外,从组织提取出来的蛋白质及其他离子、分子等也可能极大地改变溶液的pH。因此,应在其有效缓冲范围的中点处使用缓冲液。另外,进行组织提取时的一个问题是缓冲容量,它与用于组织提取溶液的体积密切相关,如用小体积提取,从组织提取的蛋白质及其他分子的浓度就高,这时要求用较高浓度的缓冲液。在许多情况下,可方便地使用较大的体积,这时用稀的缓冲液就足够了。最后,化学相容性是选择缓冲液的又一考虑。如果氨基会干扰下一步操作如阳离子交换层析的话,含有伯胺的缓冲液就不合适了。类似地,磷酸缓冲液会干扰下一步的阴离子交换层析。

除此之外,有些提取过程中的最适pH与有效成分活性稳定的pH并不一致,这一点要特别注意。

王大虎  3.其他外在因素及预防措施

如第一章所述,温度、溶剂极性和离子强度、还原剂、金属离子等外在因素均影响蛋白质的提取效果,因此,提取蛋白质时应给予全面、综合考虑,切忌生搬硬套。

(二)内在影响因素及预防措施

提取蛋白质的内在影响因素是在破碎细胞提取蛋白质的同时可释放出蛋白酶,这些酶在与欲提取的蛋白质或酶接触时,一旦条件适宜,就会发生反应,导致蛋白质分解。为了防止这个问题的发生,提取蛋白质时必须小心地采用加入抑制剂如PMSF或调节提取液的pH、离子浓度或极性等方法,使这些酶丧失活力。例如,胰岛素是胰脏中β-细胞分泌的一种蛋白质激素,它与胰脏中的胰蛋白酶共存于同一组织内,胰蛋白酶一旦活化便水解、破坏胰岛素。在抽提、纯化胰岛素时,为阻止胰蛋白酶活化,采用68%的乙醇溶液(pH2.5~3.0,用草酸调节)在13~15℃抽提3h,可得到满意的结果。因为68%乙醇可使胰蛋白酶暂时失活,草酸可除去胰蛋白酶的激活剂Ca2+,加之酸性条件不适合胰蛋白酶活化,而胰岛素在低于80%的酸性乙醇或丙酮溶液中呈溶解状态,且稳定性较好。反之,如用高于pH8.0的碱性溶液抽提,则胰岛素极不稳定,当然提取效果就很难讲了。

 

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