王大虎

王大虎:蛋白质提取液的浓缩与保存

(一)蛋白质提取液的浓缩

浓缩是低浓度的溶液除去水或溶剂变为高浓度的溶液的过程。蛋白质产品制备工艺中往往在提取后和结晶前进行浓缩。加热和减压蒸发是最常用的方法,一些分离提纯方法也能起浓缩作用。例如,离子交换法与吸附法使稀溶液通过离子交换柱或吸附柱,溶质被吸附以后,再用少量洗脱液洗脱、分步收集,能够使所需物质的浓度提高几倍以至几十倍。超滤法利用半透膜能够截留大分子的性质,很适合浓缩蛋白质样品。浓缩的方法包括沉淀法、吸附法、超滤法、减压蒸馏浓缩法和双水相萃取法等。

王大虎  1.沉淀法

沉淀是蛋白质分离纯化的主要方法之一,同时也是蛋白质溶液浓缩的常用方法之一。沉淀法浓缩的一般步骤是:首先通过改变条件或加入某种沉淀剂使目标物质沉淀,离心或者过滤收集沉淀物,然后加入少量缓冲液溶解,离心除去不溶物,所得上清液,根据实验必要可以进行透析或者凝胶过滤脱盐步骤。沉淀法由于具有成本低、收率高、设备简单、浓缩倍数高和操作简单等优点被广泛使用,但它对蛋白质浓度要求高,另外由于相变会导致收率较低。

选择沉淀方法时需要考虑沉淀剂对目的蛋白稳定性的影响、沉淀剂的成本以及操作的难易程度、沉淀剂的去留、需要浓缩的倍数等。常用的沉淀方法有:有机溶剂沉淀、等电点沉淀、盐析法沉淀、选择性变性沉淀等。其中选择性变性沉淀是利用蛋白质、酶和核酸等生物大分子对某些物理或化学因素敏感性不同,有选择地使之变性沉淀,以达到分离提纯的目的。方法可分为:①利用表面活性剂(三氯乙酸)或有机溶剂引起变性;②利用对热的不稳定性,加热破坏某些组分,而保存另一些组分;③酸碱变性。

非离子型多聚物沉淀法是另外一种用于蛋白质浓缩的方法。非离子多聚物是20世纪60年代发展起来的一类重要沉淀剂,最早用于提纯免疫球蛋白,沉淀一些细菌和病毒,近年来逐渐广泛应用于核酸和蛋白质的分离提纯。这类非离子多聚物包括不同分子质量的PEG、乙氧基壬基酚(NPEO)、葡聚糖、右旋糖酐X钠等,其中应用最多的是PEG。PEG分子在溶液中形成网状结构,与溶液中的蛋白质分子发生空间排斥作用,使蛋白质分子凝集、沉淀。使用的PEG的量和分离效果与蛋白质的分子质量、蛋白质浓度、溶液pH、PEG的平均分子质量等有关。这种沉淀方法实验操作条件温和,不易引起生物大分子的变性,沉淀效能高,很少量的沉淀剂就可以使相当多的生物大分子沉淀,且沉淀后的多聚物也容易除去,无毒、不可燃,对大多数蛋白质还有一定的保护作用,因此广泛用于蛋白质、核酸、细菌和病毒等的分离纯化。

王大虎 2.吸附法

吸附法是最简单、快速的浓缩蛋白质溶液的方法,通过吸附剂直接除去溶剂中溶剂分子使之浓缩。所用的吸收剂必须与溶液不发生化学反应,对生物大分子不吸附,易与溶液分开。常用的吸收剂有PEG、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和凝胶等。

使用PEG吸收剂时,将生物大分子溶液装入透析袋,外加PEG覆盖,置于4℃下,袋内溶剂渗出即被PEG迅速吸去。PEG被水饱和后要更换新的,直至溶液达到所要的体积。若采用小孔径的凝胶吸附,则将胶加入提取液中,根据干胶的吸水量和蛋白质溶液需要浓缩的倍数称取所需的干胶量。将加样提取液放入冰箱内,凝胶粒子吸水后,通过离心除去。

吸附法操作过程中不使用有机溶剂,操作简便安全,设备简单,吸附过程中pH变化不大,适用于稳定性较差的产物的分离。

王大虎  3.超滤法

在离心力或者较高的压力(0.2~1.0MPa)下,选择适当孔径(1~20nm)的半透膜,半透膜只允许水和其他小分子物质通过,可以将目的蛋白截留下来,最终使溶液获得浓缩。

有两种方法进行浓缩:一种是将半透膜装入高压过滤器内,使溶液中小分子渗出;另一种是将蛋白液装入透析袋内,置于真空干燥器的通风口上,负压抽气,而使袋内液体渗出。超滤对大分子的截留作用是利用了筛分原理,另外膜上表面活性层上孔的形状决定了截留效果。

大虎说事
大虎说事

应用超滤法关键在于膜的选择,不同类型和规格的膜,分子质量截留值等参数均不同,必须根据工作需要来选用。另外,超滤装置的形式、溶质成分及性质、溶液浓度等都对超滤效果有一定影响。选择超滤膜时可以依据膜的截留分子质量(MWCO),即不能通过膜的最小分子质量,但是由于膜孔径分布的不均一,在MWCO附近都有一定的分布,一般选择的膜的MWCO要比所需要的蛋白质分子质量低20%以上。

传统的膜是由纤维质材料,如醋酸纤维等组成的,来源丰富,但化学稳定性和热稳定性有限,一般要求pH3~6,T<30℃,限制了它的使用范围。随着科技的发展,一些塑料膜已经被广泛使用,如聚砜、聚酰胺、聚氯乙烯、聚碳酸酯等,这些塑料膜在广泛的化学条件下均可使用,如在pH1~13时,以及有许多有机溶剂存在时也可用,耐热稳定性可以达到80℃,一些膜还可以自动灭菌。

超滤法浓缩不涉及加热,故特别适合热敏性物质的浓缩。浓缩过程不存在相变,耗能少,操作经济,物料在透过膜的迁移过程中无性质改变,且易连续进行操作。正因为以上这些优点,这种浓缩方法已经广泛用于果汁、乳制品等食品的浓缩以及蛋白质或者多糖的浓缩分离。

王大虎 4.减压蒸馏

减压蒸馏浓缩方法是在减压真空状态下进行蒸馏,通过降低液面压力使液体沸点降低。减压的真空度越高,液体沸点降得越低,蒸发越快。一般温度在40℃以下,因此这种方法特别适用于一些不耐热的蛋白质样品的浓缩,但其浓缩的时间较长,处理量较少。

5.双水相萃取

双水相萃取是利用两种水溶性不同的聚合物或者一种聚合物和无机盐的混合溶液,在一定的浓度下,X会自然分成互不相溶的两相,通过两相分离而实现浓缩的效果,所以它也可以作为分离纯化蛋白质的方法之一。因为两相均含有较多的水(一般含70%~90%),故称之为双水相。被分离物质进入双水相X后由于表面性质、电荷间作用和各种作用力(如疏水键、氢键和离子键)等因素的影响,在两相间的分配系数K不同,导致其在上下相的浓度不同,达到分离目的。其中最常用的多聚物是葡聚糖和PEG。表2-1列出了常用的双水相系统。

表2-1 常用的双水相系统

 

这种浓缩方法X的含水量高(70%~90%),在接近生理环境的X中进行萃取,因此不会引起生物活性物质活性的丧失;可以从含有菌体细胞的发酵液或培养液中直接提取产物,如乳蛋白或酶等,容易实现工业放大和连续化操作;而且它分相时间短,自然分相时间一般为5~15min;整个操作条件温和,全过程在常温常压下进行。

目前这种方法已经广泛应用在蛋白质、酶、抗生素的提取中,如牛血清蛋白、牛酪蛋白、β-X蛋白、血清蛋白、α-淀粉酶和蛋白酶、胆固醇氧化酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油醛脱氢酶、葡萄糖淀粉酶、L-天门冬酰胺酶等都在双水相X中得到较好的分离和浓缩。

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