王大虎

王大虎:具体提取策略

王大虎  一、动物组织中蛋白质的提取

 

动物材料中的蛋白质有些是以可溶的形式存在于X(如血浆)中,这些蛋白质可以不必经过提取直接进行分离;而有些像角蛋白、胶原蛋白等一些不溶性蛋白,必须先除去一些与实验无关的结缔组织、脂肪组织,再用适当的方法提取后才能加以分离,这是动物蛋白质与其他来源蛋白质在提取方式上的主要区别。

在对动物组织中的蛋白质等生物大分子或细胞器进行分离时,首先要进行的是粗提液的制备。组织的破碎是目标物得以提取的关键。严谨而规范的实验操作技术可以获得高产量、无污染、有活性的生物大分子或细胞器。应用均质技术,可使大量细胞表面的质膜破裂,从而释放细胞溶质,但又不会对细胞亚结构、细胞器等造成广泛损害。由于动物细胞仅仅由质膜所包裹,所以从动物组织中提取生物大分子相对简单一些。与许多细菌和植物细胞相比,动物细胞相当脆弱,因此对剪切力较敏感。动物组织可被粗略地分为软组织(如肝,肾)和硬组织(如骨骼和心脏),一般可以产生液体剪切力的机械力量就可以破坏软组织,而硬组织则需要由搅拌机和碎肉机等产生的强有力的剪切力才能破坏。

王大虎  (一)动物组织的选择

根据所需提取的目标大分子的不同,选择不同的动物组织。众多因素决定了如何初步选择以纯化为目的的蛋白质组织。首先,理想的组织必须具有丰富的蛋白质含量。举例来说,肾皮质上的一些细胞表面肽酶表达水平高,器官本身相对较大,常常可以从中分离出大量的目的蛋白。

第二个必须考虑的因素是动物组织的可获得性。大型家畜(特别是猪和牛)的组织可以从各地的屠宰场获得,而小动物(如小鼠、大鼠和家兔)的组织可以从一些动物机构或者X获得。很显然,小鼠的组织适宜用来纯化少量的某种蛋白质,而猪的肝脏则适合大量提取。

另外,还有一些需要考虑的因素,如组织的新鲜度和组织破碎的难易程度。对某些蛋白质来说,使用新鲜的组织是相当重要的,而这一要求同时也会影响到对组织来源的要求和提取策略。

所以,理想的原料组织的选择依据应该是组织容易获得、目标物含量高、制备工艺简单、成本低、重现性好等。材料选定后要尽快提取以保持新鲜,若暂不提取,需冷冻保藏。在处理动物组织时,应严格遵循实验室规则。

(二)动物组织的破碎

动物组织破碎的目的是在能保持细胞活力的低温条件下,用快速的机械或超声波等方式使细胞膜破裂,让细胞内亚细胞组分逸出。常用的工具有组织捣碎器、玻璃匀浆器、超声波细胞破碎仪等。应根据不同组织细胞的特点选用不同的工具。用于破碎动物组织细胞的方法主要有机械法、超声波破碎法、高压匀浆法和溶胀法。

组织的破碎方法取决于目标物位于胞内还是胞外,目标物的可溶性还是膜结合的等。对于大型器官如猪肾脏、X等,可先用剪刀将其剪成碎片,再采用绞切器快速破碎;对于硬组织,如骨骼肌、心肌、肺等,因含较多纤维而不能直接用搅切器搅拌,需先用带有旋转叶片的碎肉器粉碎,再进行匀浆;对于软组织,如肝脏、肾脏、脑等,可采用玻璃-玻璃或玻璃-四氟乙烯均质器进行均质。如果所得物软组织含量较少,可采用简便的手提式组织均质器,使一些主要的细胞器得到释放,如细胞核、溶酶体、过氧化物酶体和线粒体,若均质的条件足够严格,内质网和高尔基体也得到释放;如果所得物软组织含量较多,则直接置于搅切器中快速破碎。组织搅切后得到的组织糜,直接加入一定比例[组织糜(g)∶缓冲液(mL)=1∶1]的缓冲液,然后通过细纱布除去悬浮的脂肪和一些大块组织等。若提取的目标物是蛋白质,根据蛋白质的不同,均质缓冲液中可能需要加入蛋白酶抑制剂。均质后,残留的大块组织可通过细纱布或者低速离心除去。均质过程应在4℃下进行,均质化时间应尽量短,以减少不必要的蛋白质水解和变性。

王大虎   (三)匀浆介质的选择

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一般情况下,选择中等离子强度及中性pH的等渗缓冲液(匀浆介质)对动物组织进行匀浆,以防因渗透力不同而使细胞器受损伤。用得最普遍的匀浆介质是用含1mmol/L EDTA和0.25mol/L蔗糖的缓冲液Tris、Mops、Hepes或TES(pH7.0~7.6)配制的。根据提取的目标物不同,匀浆介质的组成不尽相同。分离细胞核时,匀浆介质中不含EDTA,但可加入KCl或二价阳离子如Ca2+或Mg2+,可预防核膜的破裂及核DNA释放;若处理动物组织,选择Mg2+更为合适,因为Ca2+会激活特定的蛋白酶。在分离线粒体时,匀浆介质中应含非电解质如蔗糖。但如果提取的是骨骼肌中的线粒体,蔗糖的存在会导致样品的磷酸化,效率低且线粒体产量低。原因是肌肉组织中含高浓度的Ca2+,这些Ca2+在匀浆的过程中吸附(而非连接)到线粒体上。当骨骼肌在蔗糖介质中匀浆时,将形成凝胶网状结构,这种结构会抑制肌原纤维的溶解。此时,加入一定浓度的盐如KCl(100~150mmol/L)比加非电解质好。

(四)防止蛋白质的有害水解

组织均质化后,通常会将存在不同亚细胞结构内的蛋白酶释放到溶液中,并与目标蛋白质接触,很可能将其降解。根据一般规律,存在于细胞表面或以可溶形式分泌的蛋白质以及糖基化蛋白对于降解有较强的抗性。在4℃预冷的缓冲液中进行均质化操作以及后续的分离操作,对于降低蛋白质的有害水解会有帮助。通过在各种缓冲液中添加蛋白酶抑制剂,可进一步控制蛋白质水解。蛋白酶抑制剂的添加取决于目标物的性质及所使用的组织。一些特定的蛋白质或含高浓度蛋白酶的细胞器(如肝脏)对蛋白酶特别敏感。表2-2所示为提取动物蛋白时常用的蛋白酶抑制剂。

表2-2 提取动物蛋白质时常用的蛋白酶抑制剂

 

混合抑制剂在抽提动物蛋白质时也被采用。以下两种混合抑制剂可防止分离哺乳动物蛋白质过程中的有害蛋白质水解:

①EDTA(5mmol/L)、二-异丙基氟磷酸盐(Dip-F,0.1mmol/L)、反-环氧琥珀酰-L-亮氨酰氨基-(4-胍基)(E-64,10µmol/L)、抗痛素(10µg/mL)、亮肽素(10µg/mL)、抑肽素A(1µmol/L);

②EDTA(1mmol/L)、1,10-二氮杂菲(1mmol/L)、Dip-F(0.1mmol/L)、PMSF(1mmol/L)、E-64(10µmol/L)、抑肽素A(1µmol/L)。

在使用此类抑制剂时,需要考虑的关键因素之一是成本,特别是在大规模重复分离一种蛋白质时。另一个因素是在分离一种蛋白酶并通过分析酶活性质了解其纯化过程时,应避免使用此类蛋白酶的抑制剂。

王大虎  (五)亚细胞的分级分离

细胞组分经破碎释放出后,常依据其不同的沉降系数和在匀浆介质中的密度,用离心技术来加以分离。细胞和细胞器都有各自结构、组成和功能上的特点,在不同的悬浮溶液和不同的离心力场中,它们沉降的速度和在悬浮溶液中停留位置都不同。利用这一特性,通过调整悬浮溶液和离心速度,即可实现分离的目的。

如果纯化一种存在于亚细胞器中的目标物,如线粒体中的丙酮酸脱氢酶,则需要另外的步骤打开细胞器。根据亚细胞器和蛋白质的特性,采用的方法包括超声波处理、渗透溶解或匀浆器均质作用等。分离目的蛋白所在的亚细胞成分,最普遍的方法是离心,常用的是如前所述的差速离心和密度梯度离心。

(六)应用实例(大鼠肝细胞过氧化物酶体的提取)

(1)材料 健康SD大鼠,体重300g左右,鼠龄2~3个月。

(2)试剂

①生理盐水;

②提取缓冲液:0.25mol/L蔗糖、0.1%乙醇、1mmol/L Na3 EDTA、10mmol/L Tris-HCl、pH7.4;

③不连续梯度液:37.4%(质量分数)和45.8%(质量分数)的蔗糖溶液。

(3)仪器 超速离心机、RPS40T水平转头、紫外-可见分光光度计。

(4)提取步骤

①取出刚处死的大鼠的肝脏,用冷生理盐水将血迹冲洗干净。

②称取10g肝脏,用剪子剪碎后,加50mL提取缓冲液,在冰浴中匀浆(以下操作均在冰浴中进行)。将肝匀浆于4℃、3000r/min离心10min,除去组织块,取上清液备用。

③向沉淀中加入50mL提取缓冲液再次匀浆,将肝匀浆于4℃、3000r/min离心6min,弃沉淀(A—细胞核)。

④将两次离心所得上清液合并,于4℃、7000r/min离心5min,取上清液。

⑤将步骤④上清液于4℃、13500r/min离心20min,弃上清液(B—胞浆微粒体),留沉淀。

⑥沉淀中加入40mL提取缓冲液混悬后,再次于4℃、13500r/min离心20min,弃上清液,取沉淀。

⑦用3mL缓冲液将沉淀悬浮,此为过氧化物酶体的粗提物(C—富含过氧化物酶体)。

⑧在13mL的PA离心管中加入5mL 45.8%的蔗糖溶液,再缓慢加入4mL 37.4%的蔗糖溶液,制成不连续梯度液。将混悬好的过氧化物酶体的粗提物(约4mL)缓慢加在梯度液上,用RPS40T水平转头,慢加速至27500r/min,4℃离心2h。样品被分成X可见的三层分布状态(图2-3):上边一层是微粒体(Ⅲ),中间一层是线粒体(Ⅱ),最底部沉淀即是过氧化物酶体(Ⅰ)。

 

图2-3 三种细胞器组分在蔗糖梯度液中的提取

(资料来源:骆子生,2000)

⑨收集管底的沉淀,用13mL提取缓冲液悬浮,于4℃、27500r/min离心2h,洗去浓蔗糖溶液。

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