王大虎

王大虎:植物组织中蛋白质的提取

植物组织中包含有多种蛋白质,它们在性质上存在着巨大的差异,并且需要特殊的条件才能进行提取和纯化。因此,用单一的提取方案应用于所有植物蛋白质的提取是行不通的。

在初始阶段就必须考虑提取比例和可能使用到的相应型号的提取设备。在处理量大的实验中,需要组织粉碎器或功能相似的仪器;而对于组织处理量小的实验,小功率的均质机或研钵比较适宜。

用植物材料作为原料与用其他生物有机体作为实验材料无明显差异,但要注意以下几点:①植物材料必须经过去壳,植物壳细胞含有大量的纤维素,很强韧;②细胞膜破坏后,在提取阶段酚类物质氧化后变成暗褐色,与有效成分混在一起,很难除去;③细胞内有较大的液泡,里面含有很多不需要的代谢物质,细胞破碎后,它们的溶出会改变提取液的pH;④由于植物品种和生长发育状态不同,其中蛋白质的含量也不同;⑤植物材料的情况与季节有关,使用时要注意这方面的问题。另外,植物的种子、胚和花粉等与机体形态有所不同,各器官、组织所含有的蛋白质成分也大不相同。

王大虎 (一)植物组织的选择

组织的选择对植物蛋白质的获得至关重要。选择原则主要是:有效成分含量高,原料新鲜;原料来源广,易得,原料产地要近;原料中杂质含量少;原料成本低。很显然,同时具备各种有利因素的原料不多,研究者可酌情选择。在进行植物蛋白质的提取时,很少将植物整体用于蛋白质分离,通常是将一些器官如叶或茎作为主要原料,也可能利用一些特殊植物结构,选取相对均一的细胞类型作为起始材料,这种情况相对比较少。

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(二)植物细胞的破碎

要研究从植物细胞中提取蛋白质,最重要的是考察植物细胞的基本特征。植物细胞最显著的特征之一是含有具一定硬度和X的细胞壁。初生细胞壁是由生命细胞的细胞质产生的,主要由纤维素、半纤维素、果胶和结构蛋白质组成。在很多植物细胞中,一旦细胞变大并开始分化,次生细胞壁即开始形成。次生细胞壁由于含有木质素而使植物体X。其组成中除了木质素外,尚含纤维素和半纤维素,极少含果胶类物质。植物细胞最重要的生物学性质是对水溶液的通透性。细胞壁上存在荷电基团,它们能与离子型成分结合,对很多生物活性成分具有通透性。植物细胞形态上的另一个特性,就是其纤维素细胞壁使得其外骨架相当脆弱,表现为抗张力强度大,抗剪切能力小。

具体的组织破碎处理方法要视具体情况具体分析。如果实验材料为植物叶片,直接用水清洗干净即可。植物叶细胞多为初级细胞壁,比较脆弱,可直接研磨破碎,但需迅速操作且尽量在低温下。植物的茎因含纤维较多,使得其组织破碎较难,可以先切割成块状,研磨时加入一些研磨剂,然后除去可能影响随后纯化过程的物质。植物茎的蛋白质回收率也较其他组织低。实验材料若选根,需在材料处理时进行一些保护措施,因植物根中含有可溶性酚类物质和氧化酶,如过氧化物酶、多酚氧化酶等。若是选用植物种子为材料,需先将种子泡涨或粉碎后通过研磨来均质。种子中富含储存蛋白,如果目的蛋白不是储存蛋白,在提取时需增加能有效地除去这些储存蛋白的步骤。以植物果实为原材料时,应先对目的蛋白有所了解。过熟的果实可能含有过量的蛋白酶和糖苷键,造成可溶性多糖增加;绿色果实在提取蛋白质时要先在暗室存放数天,以减少因破损而释放的质体蛋白的污染。如果所需材料含油脂较多,则需先进行脱脂。植物细胞中的酚类化合物可以结合蛋白质而使之失活,其在破碎过程中也被释放出,因此需要快速提取破碎液体中的目的蛋白。

王大虎  (三)蛋白质的提取

根据植物组织的不同以及要提取蛋白质的性质应采用合适的提取液,提取后主要采用离心操作分离各个组分,提取蛋白质,得到粗提液。植物组织蛋白质提取过程中需要注意以下几个问题。

1.蛋白质浓度低

与大部分其他生物不同,植物细胞中的大量固体物质并不是蛋白质,而是包括淀粉、纤维素、果胶和半纤维素以及多酚等在内的其他大分子物质。最初的均质化必须在大量的缓冲液中进行,以便初步过滤。大量的不溶性物质由于凝胶作用或者简单的吸附作用会影响过滤,因此最初只能得到低浓度的蛋白质,需要经过沉淀或浓缩。均质化后X铵沉淀、PEG沉淀很常用。如果采用超滤浓缩,应考虑植物蛋白与膜结合的能力,以免产生负面影响。

2.蛋白质水解酶影响

植物蛋白质提取时除伴随有目的蛋白水解的问题,还伴有初始蛋白质浓度的降低。这可能是由于初始步骤操作时间过长,或者存在蛋白酶的酶解作用。植物中含有的蛋白酶主要包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和金属蛋白酶等。在材料预处理时需要加入一些蛋白酶的抑制剂,如1mmol/L的PMSF,可适用于丝氨酸蛋白酶的抑制。在实际的实验中,应根据待分离物以及其影响因素具体分析,以选择适当的酶抑制剂。

王大虎 3.褐变

酶促褐变是在有氧条件下,由于多酚氧化酶(PPO,EC 1.10.3.1)的作用,邻位的酚氧化为醌,醌很快聚合成为褐色素而引起组织褐变。多酚氧化酶是发生酶促褐变的主要酶,存在于许多植物中,它们作用于内源底物,产生活性产物,与酶反应后使其钝化,这可能是植物天然防御机制的一部分。

富含酚及酚类化合物的水果以及蔬菜等植物,如马铃薯、苹果、香蕉和甜菜,容易产生褐变反应,特别是当游离酪氨酸存在时。其他植物如豆类,组织破碎时大量释放的过氧化物酶也会引起褐变反应。通过除去底物或抑制氧化酶可以减少褐变反应。阳离子树脂(如Dowex1×2)或疏水作用树脂(如Amberlite XAD—2)可用于去除反应底物。反应抑制剂可以使用硫醇、β-巯基乙醇或DTT,也可选择抗坏血酸(但应注意对均质缓冲液pH的影响)或偏亚X氢钠。植物组织提取常用的保护剂如表2-3所示。

表2-3 植物组织提取常用的保护剂

 

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