王大虎

王大虎:叶片组织中磷酸羧化酶的提取

王大虎 (1)材料 新鲜叶片组织

(2)提取步骤

①称取100g叶片组织,切成片状,浸入500mL预冷的提取液(100mmol/L Hepes/NaOH、10mmol/L NaHCO3溶液、10mmol/L MgCl2溶液、0.1mmol/L EDTA溶液、10mmol/L β-巯基乙醇溶液、10mmol/L乙硫氮钠溶液、0.1%吐温80)中,搅拌。其中NaHCO3用来保护磷酸羧化酶的活力。

②在提取物中加入4g提取保护剂聚乙烯吡咯烷酮(PVP),过夜平衡后,于10000r/min离心30min以去除PVP以及细胞碎片。

③用X铵盐沉淀进一步抽提浓缩。加入35%的饱和X铵,同时连续搅拌直到全部溶解,并加入3g PVP。然后将提取物转移到离心管中,静置30min,于25000r/min离心15min。弃沉淀(PVP和无活力蛋白)。

④用55%的饱和X铵处理。静置过夜,同上离心。用35%~55%的饱和X铵溶液沉淀蛋白质,得到磷酸羧化酶的提取液。

王大虎 2.莲藕组织多酚氧化酶的提取

(1)材料 新鲜莲藕

(2)提取步骤

①粗酶提取:取10℃下贮藏到第8d的鲜切莲藕片组织250g,用液氮速冻,按1∶2(质量比)加入经过预冷(4℃)的0.1mol/L、pH6.8的磷酸缓冲液(内含5%的PVP)中,在高速组织捣碎机上捣碎,然后于4℃下浸提2h,用4层脱脂纱布过滤,滤液于4℃、10000r/min离心15min,上清液即为多酚氧化酶粗酶液。

②盐析分级沉淀:向粗酶液中边搅拌边加入固体X铵至30%饱和度,4℃下静置2h,于4℃、10000r/min离心10min,弃去沉淀,继续向上清液中加入X铵直至达到70%饱和度,4℃下静置过夜,然后于4℃、10000r/min离心15min,弃上清液,将沉淀用尽量少的0.1mol/L、pH6.8的磷酸缓冲液溶解,得到多酚氧化酶的提取液。

王大虎  三、细菌体重组蛋白的提取

王大虎
王大虎

重组蛋白可在大肠细菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞等X中得到高效表达,其表达形式一般可分为:①细胞外的分泌表达;②细胞内可溶性表达;③细胞内不溶性表达,即产物以包涵体的形式存在。菌体重组蛋白的提取,包括细胞破碎、溶解和提取等过程。

(一)细胞破碎

微生物的细胞破碎具有典型意义,需要根据其结构的特性选择不同方法,其结构特性见表2-4所示。

表2-4 微生物细胞的结构特性

 

根据细胞结构的特性,选用合适的破碎方法,一般来讲,机械破碎方法中,机械研磨法适用于细菌,此法效率较高。机械捣碎法适用于丝状菌,但不适用于革兰阳性菌。破碎酵母细胞核、革兰阴性菌(如大肠杆菌等)时,通常在对数生长期选用物理破碎方法,细胞破碎效果较好。有菌体重提取酶时,一般需要化X借助有机溶剂和表面活性剂等提取。此外破坏微生物的细胞壁还可选用酶法,但是此法成本较高。

王大虎 (二)重组蛋白的提取

对于细胞外的分泌表达、细胞内可溶性表达的重组蛋白,根据提取蛋白质的性质,采用合适的提取剂,然后离心分离可以得到提取液。对于细胞内不溶性表达的重组蛋白,用温和去垢剂曲拉通X-100洗涤,强的变性剂如尿素(6~8mol/L)、盐酸胍(6mol/L)、强碱,通过离子间的相互作用,打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键,使包涵体溶解而获得提取液。

(三)应用实例(重组蛋白包涵体的提取)

(1)材料 含有重组蛋白包涵体的大肠杆菌

(2)试剂

①缓冲液A:50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)、2mmol/L EDTA、100mmol/L NaCl;

②缓冲液B:50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)、1mmol/L EDTA、100mmol/L NaCl,1% NP-40;

③缓冲液C:8mol/L尿素、10mmol/L β-巯基乙醇、100mmol/L Tris-HCl(pH8.0)、2mmol/L EDTA及脱氧胆酸钠。

④缓冲液Ⅰ:50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)、2mmol/L EDTA、100mmol/L NaCl、0.5%曲拉通X-100(V/V)、4mol/L尿素;

⑤缓冲液Ⅱ:50mol/L Tris-HCl(pH8.0)、2mmol/L EDTA、100mmol/L NaCl、3%曲拉通X-100;

⑥缓冲液Ⅲ:50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)、2mmol/L EDTA、100mmol/L NaCl、0.5%曲拉通X-100、2mol/L盐酸胍。

(3)仪器 离心机、超声波清洗仪、显微镜、磁力搅拌器。

(4)提取步骤

①用缓冲液A漂洗菌体细胞(10mL/g),于6000r/min离心15min,收集菌体细胞,重复此步骤,将菌体细胞再在缓冲液A中洗涤一次。

②将漂洗过的菌体细胞悬浮于缓冲液B中,超声破碎,镜检,破碎率高于95%,于1500r/min离心30min,收集包涵体沉淀。

③将包涵体沉淀用缓冲液Ⅰ、缓冲液Ⅱ、缓冲液Ⅲ分别超声洗涤一次,于1500r/min离心10min收集包涵体沉淀。

④包涵体的溶解:用含高浓度尿素的缓冲液C溶解包涵体沉淀,室温放置30min,然后于1500r/min离心30min,留上清液。将溶解后的蛋白质适当稀释,磁力搅拌,透析过夜。

⑤溶解后的包涵体蛋白可通过亲和层析进一步纯化。

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