大虎说事

王大虎:动物组织亚细胞中蛋白质的提取

细胞由细胞膜、细胞核和细胞质组成,而细胞质中含有的若干细胞器和细胞骨架等,称为亚细胞组分。当要提取的蛋白质存在于亚细胞组分中时,首先要提取亚细胞组分,再提取其中的目标蛋白质,这样可以防止其他细胞组分中的物质对目的蛋白的干扰和污染。

细胞内各种结构的比重和大小都不相同,在同一离心场内的沉降速度也不相同,根据这一原理,常用不同介质和不同转速的离心法,将细胞内各种组分分级分离出来。亚细胞组分的提取主要有3个步骤:组织细胞破碎、分级分离(离心)和分析。

王大虎 (一)动物组织细胞的破碎

常用于破碎动物组织细胞的方法主要有:机械法、超声波破碎、高压匀浆、溶胀法。具体原理和操作见上节所述。

(二)匀浆介质的选择

动物组织细胞破碎时所用的匀浆介质应保证细胞组分富有活力,因此,常采用含一定浓度的蔗糖溶液再加入其他离子成分,以维持破碎出的细胞器等亚细胞组分的渗透压,从而防止细胞器因渗透力不同而受损伤。用的最普遍的匀浆介质是用Tris、Hepes或TES(5~20mmol/L,pH7.4~8.0)缓冲液配制。匀浆介质一般不应该是离子盐溶液,因为这类溶液往往会使外周蛋白从膜中移出。为了分离出完整性最好的亚细胞组分,往往要采用不同的匀浆介质。

1.分离线粒体常选用的匀浆介质

分离线粒体时,往往使用甘露醇或山梨糖醇,或蔗糖、甘露醇,或蔗糖、山梨糖醇,或蔗糖、甘露醇、山梨糖醇等作为渗透平衡剂。且添加螯合Ca2+的EGTA内含物有极好的优点,因这种阳离子能将氧化作用和磷酸化作用分开。出于相同原因,为移去游离的脂肪酸和溶血磷脂,其介质要补加0.5%的牛血清蛋白。

王大虎  2.分离细胞核常选用的匀浆介质

分离细胞核时,为预防核膜的破裂及核DNA的释放,缓冲液要含有多种阳离子。这种缓冲液通常含有0.25mol/L蔗糖、50mmol/L Tris-HCl(pH7.5)、25mmol/L KCl和5mmol/L MgCl2,有些则含有2mmol/L MgCl2和2mmol/L CaCl2。钙盐和镁盐存在时,可以使用低渗缓冲液。有些细胞若要分离出完整的细胞核,必须存在KCl。

3.分离内质网常选用的匀浆介质

分离内质网时,1mmol/L浓度的Mg2+有助其分离,因为它能稳定膜和核糖体之间的相互作用。二价阳离子虽然不会使膜过分地破碎,但也会引起膜之间的凝聚。高浓度的Ca2+(8mmol/L)就会引起内质网泡囊的大规模凝聚,并且在低速离心时就会沉降。

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(三)离心

细胞组分经破碎释放后,常依据其不同的沉降系数和在匀浆介质中的密度,用离心技术来加以分离。离心方法可以分为差速离心和密度梯度离心。等密度离心适用于分离密度不等的颗粒。一般地,样品组分密度差在0.05即可用等密度离心来提取,如果用超速离心,即可提取密度差在0.001的组分。

王大虎 (四)应用实例:老鼠肝脏组织的亚细胞组分的提取

(1)材料 健康老鼠肝脏组织。

(2)试剂 匀浆缓冲液[0.25mol/L蔗糖、50mmol/L Tric-HCl(pH7.5)、25mmol KCl、5mmol MgCl2]。

(3)仪器 匀浆器、冷冻离心机。

(4)提取步骤

①称取10g(湿重)老鼠肝组织,剪碎置于冰冷的烧杯中,称重。

②用匀浆缓冲液将剪碎的肝脏配成250g/L的悬浮液,然后用匀浆器反复匀浆6次。匀浆液稀释成125g/L,制备1张匀浆液涂片,做好标记,自然干燥。

③将匀浆液于冷冻离心机4℃、1500r/min离心10min。收集上清液,制备1张上清液涂片,做好标记,自然干燥。

④沉淀用相同体积预冷的缓冲液悬浮,制备1张悬浮液涂片,做好标记,自然干燥,其余悬浮液再于4℃、1500r/min离心10min。

⑤合并1500r/min下两次离心的上清液,用冷冻离心机于4℃、16000r/min离心10min。收集上清液,沉淀用相同体积预冷的缓冲液悬浮后再于4℃、16000r/min离心10min。得到的沉淀富含线粒体和溶酶体。

⑥合并16000r/min下两次离心的上清液,于超高速离心机上于4℃、110000r/min离心60min。收集上清液,沉淀加入一定体积预冷的缓冲液用匀浆器打散使之悬浮。

⑦得到的沉淀包括质膜、内质网(包含一些结合核糖体和游离核糖体)、过氧化物酶体、多核糖体、内涵体、高尔基体和其他类似的膜系统;而上清液则包括剩余的细胞成分,即可溶的成分和较小的分子,如游离核糖体。上清液与悬浮液均冷冻保存,以备后续纯化或分析。

(5)注意事项 所有操作均在4℃下进行。重金属离子是酶的强力抑制剂,因此在组织制备过程中要避免接触金属剪刀、镊子、刀等;操作过程中,如搅拌溶液或悬浮沉淀应该使用玻璃棒。此外,在实验过程中,非常重要的一点是要精确记录用于制备亚细胞器提取液的所有体积和质量。否则将无法以有意义的方式解释实验结果。

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