王大虎

王大虎:有机溶剂沉淀法

向水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂,降低溶质的溶解度,使其沉淀析出的分离纯化方法,称为有机溶剂沉淀法。其机理主要有:①亲水性有机溶剂加入溶液后降低了介质的介电常数,使溶质分子之间的静电引力增加,聚集形成沉淀;②水溶性有机溶剂本身的水合作用降低了X水的浓度,压缩了亲水溶质分子表面原有水化层的厚度,降低了它的亲水性,导致脱水聚集。

该法的优点在于:①分辨能力比盐析法高,即蛋白质或其他溶剂只在一个比较窄的有机溶剂浓度下沉淀;②沉淀不用脱盐,过滤较为容易;③在生化制备中应用比盐析法广泛。其缺点是对具有生物活性的大分子容易引起变性失活,操作要求在低温下进行。总体来说,蛋白质和酶的有机溶剂沉淀法不如盐析法普遍。使用较多的有机溶剂是乙醇、甲醇、丙酮,还有二甲基甲酰胺、DMSO、乙腈和2-甲基-2,4戊二醇等。

有机溶剂沉淀蛋白质时,需加入的有机溶剂量一般是以体积为单位按下列公式计算:

式中V——加入有机溶剂的体积,mL;

V0——蛋白溶液的原始体积,mL;

1——蛋白溶液中有机溶剂的体积分数,%;

2——蛋白溶液中欲达到的有机溶剂体积分数,%。

有多种因素影响有机溶剂的沉淀效果:①温度:低温可保持蛋白质活性,同时降低其溶解度,提高提取效率;②样品浓度和pH:与盐析法中的作用基本相同;③金属离子:一些多价阳离子如Zn2+和Ca2+在一定pH下能与呈阴离子状态的蛋白质形成复合物,这种复合物在水中或有机溶剂中的溶解度都大大下降,而且不影响蛋白质的生物活性;④离子强度:盐浓度太高或太低都对分离有不利影响,对蛋白质和多糖而言,盐浓度不超过5%比较合适,使用的乙醇量以不超过二倍体积为宜。

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三、等电点沉淀法

等电点沉淀的原理:两性电解质在溶液pH处于等电点(pI)时,分子表面静电荷为零,导致赖以稳定的双电层及水化膜的削弱或破坏,分子间引力增加,溶解度降低,从而相互聚集,沉淀析出。利用等电点除杂蛋白时必须了解制备物对酸碱的稳定性,不然盲目使用十分危险。不少蛋白质与金属离子结合后,等电点会发生偏移,故溶液中含有金属离子时,必须注意调整pH。等电点法常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀方法联合使用,以提高其沉淀能力。表3-2列举了几种酶和蛋白质的等电点。

表3-2 几种酶和蛋白质的等电点pI

王大虎  四、亲和沉淀法

将亲和试剂加入到含有靶蛋白的混合溶液中,就可以形成亲和配体-靶蛋白的共聚物。这种共聚物可以在一定条件下形成沉淀,通过过滤或离心的方式进行分离,然后将酶或蛋白质从亲和配体-聚合物上解离下来。这一过程类似于蛋白质的亲和层析,因此将这种分离提纯蛋白质的技术称为亲和沉淀。以脱乙酰几丁质作为例,可以说明亲和沉淀法分离蛋白质的基本原理与过程(图3-5)。

 

图3-5 用脱乙酰几丁质亲和沉淀法分离蛋白质原理示意图

(资料来源:庄蕾,陈冠军等,1998)

这种利用亲和沉淀分离蛋白质的方法同传统的蛋白质分离技术相比,可以显示出亲和沉淀的优越性:①它可以直接处理包含有细胞壁碎片的黏滞溶液,加入亲和性聚合物形成可溶性亲和配体复合物后,通过离心除去颗粒性物质,然后改变一定条件,使聚合物-靶蛋白共聚物发生沉淀。②亲和沉淀在分离靶蛋白的同时,可以将之浓缩成较小体积,减少了后续分离的工作量,节约了化学试剂,因而更经济有效。③可进行多级亲和沉淀,如果样品液中还包含其他有用的物质,可以使用另一种亲和沉淀剂或改变纯化策略加以分离提取。

王大虎  五、其他沉淀法

(一)生成盐复合物沉淀法

蛋白质等生物大分子和小分子都可以生成盐类复合物沉淀,此法一般可分为3种:与生物分子的酸性功能基团作用(如铜盐、银盐、锌盐、钙盐等);与生物分子的碱性基团作用(如苦味酸盐、苦酮酸盐、单宁酸盐等);无机复合盐法。

1.金属复合盐法

许多有机物质包括蛋白质在内,在碱性溶液中带负电荷,能与金属离子形成沉淀。根据有机物与它们之间的作用机制,可分为羧酸、胺及杂环等含氮化合物类,参与反应的金属离子如铜、锌、镉;亲羧酸而对含氮配基没有亲和力类,参与反应的金属离子如钙、镁、铅;亲硫氢基化合物类,参与反应的金属离子如汞、银、铅。蛋白质-金属离子复合物的重要性质是它们的溶解度对溶液的介电常数非常敏感,调整水溶液的介电常数(如加入有机溶剂),即可沉淀多种蛋白质。所用金属离子浓度约为0.02mol/L左右即可。

2.有机盐法

含氮有机酸如苦味酸、苦酮酸、鞣酸等能与有机分子的碱性功能团形成复合物而析出沉淀。但此法常发生不可逆的沉淀反应,故用于沉淀蛋白质时,需采用较温和的条件,有时还需加入一定的稳定剂。

(1)单宁 为多元酚类化合物,分子上有羧基和多个羟基,可与蛋白质分子形成氢键而结合在一起,从而形成巨大的复合颗粒沉淀下来。它沉淀蛋白质的能力与蛋白质种类、环境、pH及单宁本身的来源和浓度有关。单宁与蛋白质结合得较牢固,一般多采用竞争结合法,即选用比蛋白质更强的结合剂与单宁结合,使蛋白质游离释放出来。此类竞争型结合剂有乙烯氮戊环酮、PEG、山梨糖醇甘油酸酯等。

(2)三氯乙酸(TCA) 沉淀蛋白迅速而完全,一般会引起变性。但低温短时间作用可使一些较稳定的蛋白质或酶保持原有的活力。

大虎说事  3.无机复合盐法

常用的无机复合盐有磷钨酸盐、磷钼酸盐等。磷钼酸盐可同时沉淀高、中分子质量的蛋白质。

无机复合盐溶解度很低,极易沉淀析出。若沉淀为金属复合盐,可通以H2S使金属变成硫化物而除去;若为有机酸盐或磷钨酸盐,则加入无机酸并用X萃取,把有机酸和磷钨酸等移入X中除去,或用离子交换法除去。值得注意的是此类方法常使蛋白质发生不可逆沉淀,应用时必须谨慎。

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