王大虎

王大虎:第四章-透析和超滤

透析的原理是指溶质从半透膜的一侧透过膜至另一侧的过程,任何天然的(如腹膜)或人造的半透膜,只要该膜含有使一定大小的溶质通过的孔径,那么溶质分子就可以通过扩散和对流从膜的一侧移动到膜的另一侧。其基本原理是分子的扩散运动。扩散就是半透膜两侧液体各自所含溶质浓度梯度及它所形成的不同渗透浓度,溶质从浓度高的一侧通过半透膜向浓度低的一侧移动。透析的速度反比于膜的厚度,正比于欲透析的小分子溶质在膜内外两边的浓度梯度,还正比于膜的面积和温度。通常是4℃透析,升高温度可加快透析速度。

透析只需要使用专用的半透膜即可完成。通常是将半透膜制成袋状,将生物大分子样品溶液置入袋内,样品溶液中大分子质量的生物大分子被截留在袋内,而盐和小分子物质不断扩散透析到袋外,直到袋内外两边的浓度达到平衡为止。保留在透析袋内的样品溶液称为“保留液”,袋(膜)外的溶液称为“渗出液”或“透析液”。

在蛋白质的纯化过程中,透析主要用于除盐、除少量有机溶剂、除生物小分子杂质和浓缩样品等。

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王大虎 二、基本操作

1.透析袋的处理

商品透析袋制成管状,出厂时都用10%的甘油处理过,并含有极微量的硫化物、重金属和一些具有紫外吸收的杂质,它们对蛋白质和其他生物活性物质有害,用前必须除去。可先用50%乙醇煮沸1h,再依次用50%乙醇、0.01mol/L NaHCO3和0.001mol/L EDTA溶液洗涤,最后用蒸馏水冲洗即可使用。使用后的透析袋洗净后可存于4℃蒸馏水中,若长时间不用,可加少量叠氮化钠,以防长菌。

根据截留蛋白质分子质量的不同,透析袋具有不同的规格、型号,表4-1所示为美国联合碳化物公司(Union Carbide)生产的各种型号透析袋的规格。

表4-1 美国联合碳化物公司各种型号透析袋的规格

新透析袋也可用沸水煮5~10min,再用蒸馏水洗净,即可使用。使用时,一端用橡皮筋或线绳扎紧,也可以使用特制的透析袋夹夹紧;由另一端灌满水,用手指稍加压,检查不漏,方可装入待透析液,通常要留1/3~1/2的空间,以防透析过程中,透析的小分子质量较大时,袋外的水和缓冲液过量进入袋内将袋X。

王大虎 2.选择适当的透析液

透析的主要目的是脱盐或变更样品的缓冲X。用于脱盐的透析液可选用蒸馏水或者低浓度的缓冲液,如用于冻干的样品液可用蒸馏水作为透析液脱盐。用于变更样品的缓冲X的透析液可选用下一程序所需的缓冲液,如常压柱洗脱所得样品(0.1mol/L、pH5.0醋酸钠缓冲X)在进行下一步实验(0.02mol/L、pH7.0磷酸盐缓冲X)之前就应选用0.02mol/L pH7.0磷酸盐缓冲液作为透析液。

一般情况下,透析液均选用低离子强度的中性缓冲液。透析含有辅基的酶时,在透析液中宜加入适量的辅基或保护辅基的试剂。

3.把握透析时间

为了加快透析速度,除多次更换透析液外,还可使用磁力搅拌器。为了提高透析效率,还可以使用各种透析装置。透析操作在搅拌下进行时,样品液与透析液体积之比以1∶10较好,一般3h可以达到平衡。如透析在静止状态下进行时,则比例应该扩大到1∶20以上。为了透析完全,一般需要在溶液达到平衡后更换透析液2~3次。检查透析效果的方法是:用1% BaCl2检查X铵,用1% AgNO3检查NaCl、KCl等。

王大虎  三、应用

在蛋白质分离纯化过程中,透析主要用于盐析之后的除盐。如在酵母菌表达产物的纯化过程中,在55%X铵饱和沉淀之后,将所得的蛋白质溶液转入透析袋中,将透析袋放入10倍蛋白质溶液体积的无菌PBS中,用磁力搅拌器搅拌以促进液体平衡,去除盐类和咪唑。期间更换PBS 5~6次,并用1% BaCl2跟踪X铵透出情况,直至PBS没有白色浑浊出现。

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