大虎说事

王大虎:第五章│电泳技术

第一节 概述

电泳(Electrophoresis)是带电物质在电场作用下,向着与其电荷相反的电极移动的现象。电泳现象早在19世纪初就已发现(1808年俄国物理学家Reǔss进行了世界上第一次电泳实验)。但电泳技术的广泛应用,则是在1937年用滤纸作为支持介质成功地进行纸电泳以后,特别是近几十年以来,电泳技术发展很快,各种类型的电泳技术相继诞生,在生物化学、医学、免疫学等领域得到了广泛应用。

王大虎 一、基本原理

当把一个带静电荷(Q)的颗粒放入电场时,便有一个电场力(F)作用于其上。F的大小等于质点所带净电荷量(Q)与电场强度(E)的乘积,可用下式表示:

由于F的作用,使带点颗粒在电场中向一定方向泳动。质点的前移还要受到阻力(F′)的影响,对于一个球形质点,服从Stoke定律,即:

式中r——质点半径,m;

η——介质黏度,Pa/s;

υ——质点移动速度,m/s。

当质点在电场中作稳定运动时F=F′

王大虎
王大虎

可见,球形质点的迁移率,首先取决于自身状态,即与所带电量成正比,与其半径及介质黏度成反比。除了自身状态的因素外,电泳X中其他因素也影响质点的电泳迁移率。带电荷的供试品(蛋白质、核苷酸等)在惰性支持介质(如纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等)中,于电场的作用下,向其对应的电极方向按各自的速度进行泳动,使组分分离成狭窄的区带,用适宜的检测方法记录其电泳区带图谱或计算其百分含量。

电泳迁移率(m)是指在单位电场强度(E)(1V/cm)时的泳动速度µ,即:

式中d——带电颗粒泳动的距离,cm;

l——支持物的有效长度,cm;

t——通电时间,s;

V——加在支持物两端的实际电压,V。

1.颗粒性质

颗粒直径、形状以及所带的净电荷对泳动速度有较大影响。一般来说,其余条件不变情况下,颗粒带净电荷量越大,或其直径越小,或其形状越接近球形,在电场中的泳动速度就越快。反之,则越慢。

王大虎 2.电场强度

电场强度是指单位长度的电位降,也称电势梯度。如以滤纸作支持物,其两端浸入到电极液中,电极液与滤纸交界面的纸长为20cm,测得的电位降为200V,那么电场强度为200V/20cm=10V/cm。当电压在500V以下,电场强度在2~10V/cm时为常压电泳。电压在500V以上,电场强度在20~200V/cm时为高压电泳。电场强度大,带电质点的迁移率加快,因此省时,但因产生大量热量,应配备冷却装置以维持恒温。

3.溶液的pH

溶液的pH决定被分离物质的解离程度和质点的带电性质及所带净电荷量。例如蛋白质分子,它是既有酸性基团(—COOH),又有碱性基团(—NH2)的两性电解质,在某一溶液中所带正负电荷相等,即分子的净电荷等于零。此时,蛋白质在电场中不再移动,溶液的这一pH为该蛋白质的等电点。若溶液pH处于等电点酸侧,即pH<pI,则蛋白质带正电荷,在电场中向负极移动。若溶液pH处于等电点碱侧,即pH>pI,则蛋白质带负电荷,向正极移动。溶液的pH离pI越远,质点所带净电荷越多,电泳迁移率越大。因此在电泳时,应根据样品性质,选择合适的pH缓冲液。

4.溶液的离子强度

电泳液中的离子浓度增加时会引起质点迁移率的降低。其原因是带电质点吸引相反电荷的离子聚集在其周围,形成一个与运动质点电荷相反的离子氛(ionic atmosphere),离子氛不仅降低质点的带电量,同时增加质点前移的阻力,甚至使其不能泳动。然而离子浓度过低,会降低缓冲液的总浓度及缓冲容量,不易维持溶液的pH,影响质点的带电量,改变泳动速度。离子的这种障碍效应与其浓度和价数相关,可用离子强度I表示。

王大虎5.电渗

在电场作用下液体对于固体支持物的相对移动称为电渗(electroosmosis),如图5-1所示。其产生的原因是固体支持物多孔,且带有可解离的化学基团,因此常吸附溶液中的正离子或负离子,使溶液相对带负电或正电。如以滤纸作支持物时,纸上纤维素吸附OH-带负电荷,与纸接触的水溶液因产生H3O+,带正电荷移向负极。若质点原来在电场中移向负极,结果质点的表现速度比其固有速度要快;若质点原来移向正极,表现速度比其固有速度要慢,可见应尽可能选择低电渗作用的支持物以减少电渗的影响。

图5-1 电渗现象示意图

(资料来源:何忠效,2004)

6.焦耳热

在电泳过程中,电流强度与释放出热量(Q)之间的关系可列成如下公式:

式中R——电阻,Ω;

I—电流强度,A;

t——电泳时间,s。

公式表明,电泳过程中释放出热量与电流强度的平方成正比。当电流强度或电极缓冲液以及样品中离子强度增高时,电流强度会随着增大。这不仅降低分辨率,影响泳动速度,而且在严重时会烧断滤纸或融化琼脂糖凝胶支持物。

王大虎 7.筛孔

支持物琼脂和聚丙烯酰胺凝胶都有大小不等的筛孔,在筛孔大的凝胶中溶质颗粒泳动速度快。反之,则泳动速度慢。

除上述影响泳动速度的因子外,温度和仪器装置等实验条件也应考虑。

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