大虎说事

王大虎:电泳的分类

电泳的种类繁多,但基本原理一致,按分离原理和有无支持物分别分类如下。

(一)按分离的原理分类

按分离的原理,可分为区带电泳、移界电泳和稳态电泳。

王大虎 1.区带电泳

区带电泳是指有支持介质的电泳,待分离物质在支持介质上分离成若干区带。支持介质的作用主要是防止电泳过程中的对流和扩散,以使被分离的成分得到最大分辨率的分离。区带电泳由于采用的介质不同以及技术上的差异,又可分为不同的类型。根据其所用支持物的性质,大体可分为两类:一类是仅起支持和抗扩散、抗对流作用的物料,比如滤纸、纤维素及其衍生物(如醋酸纤维素、DEAE-纤维素等);另一类物料则是不仅起支持和抗扩散、抗对流作用,而且还具有分子筛功效,比如淀粉、琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶等。淀粉凝胶电泳多用于同工酶分析,凝胶铺厚些,可一层一层剥层分析(一板多测)。天然淀粉经加工处理即可使用,但孔径度可调性差,并且由于其批号之间的质量相差很大,很难得到重复的电泳结果,加之电泳时间长,操作麻烦,分辨率低,实验室中已很少使用。琼脂糖有一个相对较大的孔径,用来分离大分子例如核酸、大蛋白和蛋白复合物。聚丙烯酰胺形成孔径较小的胶,适合于分离大多数蛋白质和多肽。

王大虎 2.移界电泳

胶体溶液的溶质颗粒经过电泳后,在胶体溶液和溶剂之间形成界面的电泳过程。最简单的移界电泳是在一U形管中装入一定量的带色胶体溶液,如黄色硫化砷胶体溶液或血红蛋白溶液,然后小心地分别在此管两端注入等量的稀电解质溶液(NaCl溶液或一定pH的缓冲液),使其与胶体溶液之间有明显的界面。接着在该管两端插入铂电极,通直流电,过一段时间即可看到一边胶体溶液的界面上升,另一边则下降,这是胶体颗粒产生泳动的结果。移界电泳法具有重要的历史意义,它的成功在于巧妙地解决了几个问题:能形成清晰的起始界面;靠密度梯度能够稳定界面;能良好地散热;在泳动过程中可用光学方法显示其组分。但为了得到清晰的界面,以及使界面移动能用光学系统反映出来,通常需要一套复杂的电泳仪装置,这就使移界电泳的广泛应用受到了限制。

3.稳态电泳

样品分子的电泳迁移在一定时间后达到一个稳态,包括等电聚焦和等速电泳。等电聚焦即由多种具有不同等电点的载体两性电解质在电场中自动形成pH梯度,被分离物质则各自移动到其等电点而聚成很窄的区带,该方法分辨率很高。等速电泳即在电泳达到平衡后,各区带相随,分成清晰的界面,以等速运动。

(二)按有无固体支持物分类

根据电泳在溶液中进行还是在固体支持物上进行,又可分为X电泳和支持物电泳两大类。

1.X界面电泳

又称移动界面电泳,是指在没有支持介质的溶液中进行的电泳,包括等速电泳、柱电泳、显微镜电泳等。因为其电泳仪构造复杂、体积庞大、操作要求严格、价格昂贵等,X界面电泳的发展并不迅速。

王大虎 2.支持物电泳

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即区带电泳,待分离物质在支持介质上分离成若干区带。这是应用最多的电泳形式。

作为一种分析工具,电泳简单、快速,并且具有高灵敏度。此方法主要用来研究单一、带电荷的分子的特性,也用来作为一种分离技术。本章将着重讨论以聚丙烯酰胺凝胶作为支持物的凝胶电泳法的基本原理和具体操作。

王大虎 第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳

以淀粉胶、琼脂或琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等作为支持介质的区带电泳法称为凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持物的一种电泳方法,人为控制聚丙烯酰胺凝胶聚合成孔径的大小,通过类似分子筛的作用把蛋白质分开。可用于蛋白质、酶、核酸等生物大分子的分离、定性、定量及制备,并可测定其相对分子质量和等电点,研究蛋白质的构象变化等。聚丙烯酰胺凝胶可用于常规及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳、双向电泳、聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳及蛋白质印迹等。

一、基本原理

聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel)是由单体丙烯酰胺(acrylamide,简称Acr)和交联剂N,N′-甲叉双丙烯酰胺(N,N′-methylenebisacrylamide,简称Bis)在催化剂和加速剂作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。

(一)聚丙烯酰胺凝胶的合成

1.凝胶总浓度与凝胶特性

凝胶溶液中单体和交联剂的总浓度和两者的比例是决定聚丙烯酰胺凝胶特性,包括其机械性能、X、透明度、黏着度及孔径大小的主要参数。通常凝胶的筛孔孔径、透明度和X是随着凝胶浓度的增加而降低的,而机械强度却随着凝胶浓度的增加而增加。1962年Hjertén S引入两个计算公式,即凝胶总浓度(T)是表示凝胶溶液中单体和交联剂的总百分含量。

交联度(C)是表示凝胶溶液中交联剂占单体和交联剂总量的百分含量。

式中ma——Acr的质量,g;

mb——交联剂Bis的质量,g;

V——溶液的终体积,mL。

ma与mb的比值对凝胶的筛孔孔径、透明度和机械强度等性质也有明显的影响。当ma∶mb小于10时,凝胶脆且硬,不透明,呈乳白色;当ma∶mb大于100时,即使使用5%的丙烯酰胺凝胶,也呈糊状,且易断裂;通常用ma∶mb在30左右,并且丙烯酰胺浓度高于3%,凝胶富有X并且透明。

2.凝胶孔径大小与浓度和交联度的关系

聚丙烯酰胺凝胶的有效孔径取决于凝胶的总浓度T和交联度C。有效孔径随着T的增加而减小,电泳中带电颗粒移动时受到网孔的阻力增大。当凝胶总浓度小于2.5%时,可以筛分相对分子质量为106以上的大分子,但此时凝胶几乎是液体,通常要加0.5%的琼脂糖来增加凝胶的硬度而不影响凝胶的孔径大小;当凝胶浓度大于30%时,则可以筛分分子质量小于2ku的多肽,在凝胶总浓度一定时,交联剂(Bis)含量不同影响凝胶的孔径,交联剂的含量与不同凝胶浓度平均孔径之间的关系见表5-1。

如表5-1所示,当Bis占总凝胶浓度5%时,凝胶的平均孔径在各凝胶浓度时均最小,高于或低于5%时孔径相应变大。

表5-1 交联剂Bis的含量与不同凝胶浓度平均孔径之间的关系

凝胶孔径大小有一定范围,每次制备凝胶时所得到的有效孔径不完全相同。

3.凝胶总浓度与凝胶的分子筛效应

凝胶的三维网状结构具有分子筛效应,在凝胶中生物大分子的分离取决于它的净电荷和分子大小。分子筛效应的大小取决于凝胶孔径大小与生物大分子大小相接近的程度。凝胶浓度不同,平均孔径也不同,不同大小和形状的大分子通过孔径时所受的阻滞力也不同,加上大分子的电荷效应,通过各种大分子迁移率不同得以分离。在实际工作中,常依据待分离蛋白质已知相对分子质量的大小来选择合适的凝胶浓度,使蛋白质混合物得到最大限度的分离,表5-2所示为得到良好分离效果时,蛋白质和核酸相对分子质量与凝胶浓度的关系。大多数蛋白质在7.5%凝胶中能得到满意的分离结果,所以这个浓度的凝胶称为标准胶。当分析一个未知样品时,常用标准胶或梯度凝胶来测试,而后确定适宜的凝胶浓度。

表5-2 得到良好分离效果时蛋白质和核酸相对分子质量与凝胶浓度的关系

4.聚丙烯酰胺凝胶的聚合方式

聚丙烯酰胺凝胶聚合机理是通过氧游离基(free radicals)提供的催化作用,使X发生氧化还原作用来完成的。催化X主要有化学催化和光化学催化X。

(1)化学催化系统 丙烯酰胺的化学催化聚合过程是在引发剂和加速剂组成的系统中完成的。参与反应的引发剂有过X铵(APS)或过X钾、过氧化氢等,而参与反应的加速剂则有二甲胺丙腈和N,N,N′,N′-四甲基乙二胺(TEMED)等。由于丙烯酰胺聚合时,可在酸性或碱性条件下进行,所以选用的引发剂和加速剂就应随着碱性变化而变化(表5-3)。

表5-3 丙烯酰胺聚合时常用的催化系统

APS-TEMED催化X属于化学聚合作用X,TEMED是一种脂肪族叔胺,它的碱基可催化溶液中的AP使其形成X根X基,S2→,激活Acr形成单体长链,如图5-2所示。

图5-2 Acr形成单体长链

含有这种多聚体链的溶液尽管比较黏稠,但不能形成凝胶。只有在交联剂Bis的作用下长链彼此交联聚合成凝胶,反应式如图5-3所示。

图5-3 Acr聚合成凝胶

聚合反应受各种因素的影响,如系统中催化剂和加速剂的浓度、pH、温度、分子氧和杂质含量都会影响凝胶的聚合过程。一般在室温下比在0℃时聚合快,溶液预先抽气的比不抽气的聚合快。

(2)光催化系统 核黄素-TEMED催化系统属于光聚合作用系统,聚合原理是核黄素在光照条件下分解,被还原成无色核黄素,后者在有少量氧的条件下,被氧化形成X基,从而引发聚合反应。通常将混合液置于一般荧光灯旁,即可使反应发生。用核黄素聚合时,可不加TEMED,但是其加入后可以加速聚合。用这种催化剂的优点是,用量极少,对分析样品无任何不良影响;聚合时间可以通过改变光照时间和强度来延长或缩短。

光聚合反应受许多因素的影响:大气氧可以淬灭X基,阻止多聚体链长的增加。在进行聚合前,一般用减压抽气的办法除去溶液中溶解的空气。在胶液表面覆盖一层水或溶液隔绝空气,可加速聚合;低温、低pH都会减慢聚合反应速度;有些材料如聚丙烯酸甲酯有机玻璃及一些金属等可抑制聚合反应。

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