王大虎

王大虎:分离效应

用凝胶电泳分离蛋白质样品时,在不连续PAGE中有三大物理效应,即浓缩效应(发生于浓缩胶中)、电荷效应和分子筛效应(发生于分离胶中),见图5-4。

图5-4 电泳过程示意图

A—电泳前3层凝胶排列顺序,3层胶中均有快离子、慢离子

B—显示电泳开始后,蛋白质样品夹在快、慢离子之间被浓缩成极窄的区带

C—显示蛋白质样品分离成数个区带

(资料来源:何忠效,2004)

王大虎  1.浓缩效应

如图5-5所示,凝胶由两种不同的凝胶层组成。上层为浓缩胶,下层为分离胶。浓缩胶为大孔胶,缓冲液pH6.7,分离胶为小孔胶,缓冲液pH8.9。在上下电泳槽内充以Tris-甘氨酸缓冲液(pH8.3),这样便形成了凝胶孔径和缓冲液pH的不连续性。

王大虎
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图5-5 浓缩效应示意图

(资料来源:何忠效,2004)

在浓缩胶中HCl几乎全部解离为Cl-,但只有极少部分甘氨酸解离为H2NCH2COO-。蛋白质的等电点一般在pH5左右,在此条件下其解离度在HCl和甘氨酸之间。当电泳系统通电后,这3种离子都向阳极移动。其有效泳动率依次为Cl->蛋白质>H2NCH2COO-,故Cl-称为快离子,而H2NCH2COO-称为慢离子。电泳开始后,由于快离子的泳动速率最大,就会很快超过被分离物,因此在快离子后面,形成一个离子浓度低的区域,这时就有了较高的电位梯度。这种高电位梯度使后面被分离物和慢离子在快离子后面加快移动。当快离子、被分离物和慢离子的泳动速率相同时,建立一种稳定状态,这时在快离子和慢离子之间形成一个稳定而又不断向正极移动的界面。由于蛋白质的有效泳动率恰好介于快慢离子之间,因此蛋白质离子就集聚在快慢离子之间被浓缩成一条狭窄的中间层,这种浓缩效应可使蛋白质浓缩数百倍。

2.电荷效应

样品进入分离胶后,慢离子甘氨酸全部解离为负离子,泳动速率加快,很快超过蛋白质,高电压梯度随即消失。此时蛋白质在均一的外加电场下泳动,但由于蛋白质分子所带的有效电荷不同,使得各种蛋白质的泳动速率不同而形成一条条区带。所以各种蛋白质样品经分离胶电泳后,若样品组分的分子质量相等,则它们就以圆盘状或带状按电荷顺序一个一个地排列起来。但SDS-PAGE中,各种SDS-蛋白质复合物在电泳中不同的泳动率与蛋白质所带电荷无关,因为SDS这种阴离子表面活性剂可以降低或消除蛋白质天然电荷差别。

王大虎  3.分子筛效应

分子质量或分子大小和形状不同的被分离物通过一定孔径分离胶时,受阻塞的程度不同而表现出不同的迁移率,这就是分子筛效应。经过浓缩效应后,前导离子(快离子)、被分离物和尾随离子(慢离子)均进入分离胶中,这时胶的pH不同,使得前导离子与尾随离子的迁移率相同,不再形成高电位梯度,所有物质在同一、均一电压梯度下迁移。这时分子质量大小和形状与其迁移率密切相关,分子质量小并且为球形的移动快。

二、基本操作

PAGE的种类繁多,如圆盘电泳、不连续垂直板状电泳和水平平板电泳。但就其操作而言,却是大同小异。此处主要讨论不连续垂直板状凝胶电泳的操作。

(一)不连续垂直板状凝胶电泳装置

不连续垂直板状凝胶电泳装置通常由稳流电泳仪和平板电泳槽组成。

常见的一种电泳槽是垂直夹心板状(图5-6)。电泳槽一般包括上、下各一个缓冲液槽。上面的缓冲液槽用于盛缓冲液和电泳时支撑凝胶板。下面的缓冲液槽除了盛缓冲液外,还用于支撑上面的缓冲液槽和冷却系统。电极由铂金丝制成,在安全盖上有两个接头与电源相连。根据可以同时电泳凝胶的数目分为单板和双板电泳槽。它的胶板模则是由两块正方形或长方形、大小适中、性质均一的玻璃板,数种不同厚度的U形软硅橡胶槽和一个“梳子”组成。

图5-6 夹心垂直板电泳槽示意图

1—样品槽模板 2—长玻璃板 3—凹形橡胶框 4—样品槽模板 5—固定螺丝 6—上贮槽 7—冷凝系统

(资料来源:何忠效,2004)

电泳仪是一种恒压恒流的电源装置,其量程通常为600V、100mA。

(二)电泳步骤

1.安装玻璃板

将两块干净的凝胶板中间用胶条密封,用电泳夹将凝胶板夹好,保持良好的密封性,可用石英水检测有无泄漏。

王大虎 2.制备分离胶

按表5-4配制各种储液,置冰箱保存备用。根据分离样品的性质选择一定的凝胶浓度,按表5-5配制分离胶溶液。把配好所需浓度的分离凝胶溶液,用接种针将其引流入两玻璃板之间至板顶1cm多处停止灌胶,然后加入适量无水乙醇或重蒸水,使其接口平齐,同时也可使其与空气隔绝,以利聚合。一般情况下,置室温0.5h左右即可以聚合,再过0.5h即聚合完全。

表5-4 不连续电泳的丙烯酰胺凝胶缓冲液X

续表

表5-5 不连续电泳的丙烯酰胺凝胶凝胶X

续表

3.预电泳

倾去聚合好的凝胶板上端的无水乙醇,插入电泳装置中,以制备分离胶的缓冲液作为电极液,电泳0.5~2.0h,电压180V,此过程为预电泳。预电泳的目的在于除去分离胶聚合后残留的APS,以免它使某些样品(如蛋白酶等)失活或产生以外的影响;另外,为确保电泳参数的恒定,还应除去未聚合的丙烯酸以及能吸收紫外光的杂质。

预电泳不能在加浓缩胶X行,也不能在电极缓冲液中进行。否则会破坏电泳的不连续系统。如在电极缓冲液和样品液中加入1%~5%的β-巯基乙醇或β-DTT,则不进行预电泳也可消除残留APS的氧化作用。预电泳后,可直接加浓缩胶,或者在含有少量重蒸水的分离胶顶端加液体石蜡封闭,置4℃可储存数天。使用时,需将分离胶顶部的溶液吸去。

4.浓缩胶的制备

用滴管小心地吸去已配好分离胶的上层重蒸水,再用滤纸条吸干,而后加浓缩胶,配方见表5-5。加浓缩胶到接近凝胶板顶端时,插入与凝胶厚度一样的“梳子”。浓缩胶的制备如用核黄素作催化剂聚合时,应在胶板上方10cm处挂一根日光灯管,照射6~7min后,凝胶变为乳白色,表明聚合开始,再照射0.5h,则聚合完全,然后X梳子,于是在聚丙烯酰胺胶中便铸就若干个样品的凹穴。

5.加样

将用浓缩胶缓冲液溶解的样品(1mg/mL)10~200µL与过量的稳定电流介质溶液(体积分数为30%的蔗糖或甘油与0.01%指示剂配制的水溶液)混匀后,用微量注射器按顺序从凝胶板顶部加样,每个凝胶孔加样品15~20µL,稀溶液最多可加150~200µL。加样时,微量注射器的针头伸入凝胶孔的内部,但针头不要碰到胶面,缓缓加入,因样品相对密度较大,因此样品液自动沉降在胶面上平铺成一层。

6.电泳

浓缩胶一旦制备完毕,就不宜储存了,而应立即进行电泳。加样前,先把凝胶板旁边的密封胶条除去,请勿将凝胶板拉坏或产生气泡。将电解液注入电泳槽中,将固定在架子上的凝胶板按正负极接通电源,打开电泳仪(仔细观察正负极的变化)。一般是样品进分离胶前电流控制在15~20mA,1520min;样品进入凝胶以后,再将电流调至40~50mA,保持电流强度不变。待指示染料迁移至下沿约0.5cm处关闭电源,停止电泳,取出凝胶板。用过的电极缓冲液(因pH发生了变化,故要把正负极溶液混匀),可重新使用1~2次。

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