王大虎

王大虎:剥胶和固定

将凝胶板放入装满水的染色槽内,用注射器装满水,其针头沿板壁内侧插入,边前进,边注水;将短板玻璃撬开,再用水缓慢冲击凝胶,直到凝胶从玻璃板上脱离。取胶时切忌损伤胶面,否则影响扫描效果。把取出的凝胶浸泡在7%乙酸或12.5%三氯乙酸水溶液中几分钟到几小时,以固定其中含有的蛋白质组分。有时也可把凝胶直接浸泡在染色液中,使固定和染色同时进行。

8.染色及脱色

用染料和生物大分子结合形成有色的复合物是电泳后检测最常用的方法。选择高吸光系数的染料,与生物大分子紧密结合,形成有色不溶的复合物,而支持介质不吸附染料,便于背景的脱色,有利于蛋白质条带的辨别和定量扫描,从而检测出蛋白质的纯度、含量及生物活性。可用于蛋白质电泳条带的染色方法很多,常用的主要有以下3种:

(1)氨基黑、考马斯亮蓝以及银试剂检测 蛋白质染色最早是用氨基黑类染料,这是一类含有磺酸基的酸性染料,它通过磺酸基与蛋白质的碱性基团形成复合盐。常用的有:氨基黑10B(amino black 10B)、萘黑12B 200(naphthalene black 12B 200)、萘酚蓝黑6B(naphthol 6B)、水牛黑(buffalo black)等。这类染料对不同的蛋白质着色不同,有蓝色、棕色、黑色,借此可以鉴别不同类型的蛋白质。这类染料对不同的蛋白质结合量不同,染色不均一和深背景会影响蛋白质的定量。但其因染色灵敏度较低,已很少应用,被灵敏度较高的考马斯亮蓝所代替。

考马斯亮蓝染色法可分为R和G型两类:R型为三苯基甲烷(triphenylmethane),每个分子含有两个—SO3H基团,本身偏酸性,磺酸基与蛋白质的碱性基团结合形成染料-蛋白质复合物。G型为二甲花青亮蓝(xylene cyanine brilliant blue),是一种甲基取代的三苯基甲烷。考马斯亮蓝R-250,结构如图5-7,是通过范德瓦尔斯键与蛋白质结合,尤其适用于SDS电泳微量蛋白质染色。它与不同蛋白质结合呈现出基本相同的颜色,并且在比较宽的范围(15~20µg)扫描峰的面积与蛋白量呈线性关系。考马斯亮蓝G-250染色灵敏度不如R-250,其优点是在三氯乙酸中以胶体形式存在,能选择性地和蛋白质形成复合物,染色迅速,着色深的蛋白质区带在数秒内即可显现出来,约45min后着色最深,背景浅,重复性好,适用于定量分析。

王大虎
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图5-7 考马斯亮蓝G-250与R-250结构式

另外,银染色法是将结合在蛋白上的Ag+(碱性条件),通过柠檬酸或乙酸的酸化或甲醛的作用,使Ag+还原成Ag,并以颗粒状沉积在蛋白部位,呈现谱带。若显示谱带的凝胶再用Na2CO3溶液处理,可增强染色效果。其银染操作方法见表5-6和表5-7,银染显色的方法大致可以分光显色和化学显色两类。化学显色法又分为双胺银染法和非双胺银染法。双胺法是用碱性的NH4OH形成银-双胺复合物,固定后的凝胶浸泡在此溶液中,通过酸化(通常用柠檬酸)显像,使用较广泛。非双胺法是将固定的凝胶置于酸性的硝酸银溶液中,Ag+与蛋白质发生作用,在碱性条件下,用甲醛将Ag+还原为Ag而显像,用酸性溶液(柠檬酸或醋酸)终止显色反应,用Na2CO3处理凝胶可进一步增强银染色的强度。非双胺法的灵敏度较双胺法高10倍。光显色的显色反应是固定后的凝胶在酸性环境中用光能将Ag+还原成Ag而使蛋白条带显色。它的优点是操作程序简单,使用一种染色溶液即可达到显色目的。近年来,银染色法应用较多。其原因是它的灵敏度比考马斯亮蓝染色高100倍。尤其是De Moreno等综合了银染色法和考马斯亮蓝染色法的优点,建立了一种与考马斯亮蓝染色法相结合的银染色法,其灵敏度比银染法又提高了2.2~8.6倍,应用范围也由聚丙烯酰胺凝胶扩大到了SDS-聚丙烯酰胺凝胶。几种染色方法灵敏度的比较见表5-8。

表5-6 银染方法的溶液配方

表5-7 银染方法操作步骤

表5-8 几种染色方法的灵敏度比较

(2)荧光探针方法检测 这是一种在电泳前用荧光分子将蛋白质共价偶联标记,于电泳后通过扫描来测定荧光区带的方法,可分为两种:一种是把蛋白质待测物先用荧光试剂(如丹磺酰氯、荧光胺等)标记,生成发荧光的复合物,此物经凝胶电泳后,置紫外灯下(约360nm)可呈现出荧光谱带,即蛋白质谱带;另一种是将蛋白质待测物先进行凝胶电泳,而后凝胶条浸泡于相应试剂如2-甲氧基-2,4-二苯-3(2H)-呋喃(MDPF)、邻苯二甲酸二醛(OPA)和1-苯胺-8-萘磺酸盐(ANS)溶液中,即可呈现出蛋白质荧光谱带。荧光胺本身及其水解产物均不发光,只有在其与蛋白质结合时,才显荧光。这样就可降低背景值,提高检测灵敏度(5mg),但所显示的荧光仅能保持2h,而用MDPF试剂标记蛋白质显出的荧光则可维持数月。一般用OPA试剂检测蛋白质谱带的灵敏度比荧光胺高10倍,而且能保持大部分酶活。其简要操作是,将电泳后的凝胶浸于含β-巯基乙醇(20~80µL)的0.1mol/L巴比妥或磷酸缓冲液(pH8.0,100mL)中,10~25min后,移至暗室OPA溶液(20mg OPA溶于2mL甲醇)中,保持15min,在紫外灯下(365nm)蛋白质显示荧光谱带。ANS试剂检测凝胶中蛋白谱带的方法是,令凝胶置于0.03g/L ANS-0.1mol/L磷酸缓冲液(pH6.8)中5~10min,移至紫外灯下,蛋白质可显示荧光谱带。采用荧光标记方法,除检测凝胶中蛋白质谱带外,还可用于检测凝胶中的糖化合物谱带,其灵敏度和分辨率也都较好。

(3)特殊蛋白质染色

①糖蛋白染色是糖蛋白通过对蛋白质或糖链的染色来检测的方法。如与糖链的反应,用过碘酸-Schiff试剂(periodic-Schiff’s reagent)染色,简称PAS染色,显色结果在543nm处可观测到颜色。检测灵敏度,最高可以达到40ng糖蛋白。

②脂蛋白染色是检测脂蛋白的常规染色方法,苏丹黑B(sudan black B)是常用的染料,银染法仍然是最灵敏的方法。近年有报道一种双染色方法,先用一种发荧光的染料Filipin使脂蛋白染色,再用考马斯亮蓝使其他蛋白染色,这样就可以在一块凝胶上同时检测出脂蛋白和其他蛋白质,灵敏度高,可检测低至20ng低密度脂蛋白。

③铁蛋白染色针对血红蛋白、转铁蛋白和其他含铁蛋白用的多种方法检测,如普鲁士蓝显色,它与蛋白质分子中的铁离子结合,方法十分简便。

④铜蛋白染色可用茜素蓝S(alizalin S)显色,它与蛋白质分子中的铜离子结合,蛋白质条带为蓝色。

⑤酶活力染色是为了适合分子质量大的底物,或说为了更适合多酶参与的反应系统,在胶条上呈现出色谱带特点而设计的。

⑥免疫学染色是一种简单而且专一性的检测方法。将辣根过氧化物酶或放射性同位素标记的抗体用于免疫检测,经过酶与底物的显色反应,使与抗体免疫结合的蛋白质条带清晰地显现出来。现在最常用的方法是凝胶电泳后通过电泳印迹将蛋白质转移到固定化膜上,然后利用相应的抗体进行免疫检测。

 

 

三、应用

 

一般单向PAGE多用于分离具有活性的生物物质,而双向或梯度PAGE则宜用于较难分离鉴定的生物大分子物质。如结合SDS以测定蛋白质亚基的分子质量;结合孔梯度进行自然蛋白质分子质量的测定;加入两性载体电解质,可分析蛋白质的等电点;还可进行印迹转移分析。但是它也存在不足,如应用于凝胶电泳的化学物质多具有毒性;分离活性物质时使其易丧失活性;不能大量制备生物大分子等。

闫美荣等分析了615纯系小鼠血清中的蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶上的分布,进行了定位分析。采用高pH不连续PAGE系统,可获得清晰的蛋白质区带,分离出13~15条区带(图5-8)。

根据染色方法的不同,各种蛋白质显示不同的谱型,且各自泳动率及百分含量存在差异。结果表明:脂蛋白呈现3条区带、白蛋白呈现2条区带、铜蓝蛋白呈现1条区带、血红蛋白呈现1条区带、结合珠蛋白呈现3条区带、糖蛋白呈现5条区带,并以已知蛋白质Rm值求出每条区带的泳动率(表5-9)。

表5-9 蛋白质区带及泳动率(±s)

 

蛋白质定位分析后,将血清蛋白质电泳胶柱在560nm处进行了光密度扫描,确定了血清中各种蛋白质的含量百分比(表5-10)。用高pH不连续性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白质定位分析是一种分辨率高,简单易行的方法,可使蛋白质准确定位。

 

图5-8 615小鼠血清蛋白质区带定位

(资料来源:闫美荣,1999)

Gp—糖蛋白 Lp—脂蛋白 A—白蛋白 M—α2巨球蛋白 Cp—铜蓝蛋白 Hp—结合珠蛋白 Hb—血红蛋白 Tf—运铁蛋白 γ1A、γ1M、γ皆糖蛋白

表5-10 血清中各种蛋白质含量百分比

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