王大虎

王大虎:SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

在聚丙烯酰胺凝胶中加入适量的SDS或尿素,或SDS-尿素后,用其作支持物进行的凝胶电泳称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。此电泳可用于单链DNA、寡核苷酸片段以及蛋白质亚基、膜蛋白、肽类等物质的分析,还可用于研究大分子物质的折叠结构等方面。实验中一般取已知分子质量的蛋白质作“标准蛋白”(marker)与被测样品在同一条件下进行电泳,就可测出被测样品的分子质量。若同时加入还原剂如β-巯基乙醇,可使蛋白质分子内的二硫键被打开,这样分离出的谱带即为蛋白质亚基,从而可以分析蛋白质的二硫键情况。

一、基本原理

由于SDS带有大量的负电荷,消除了蛋白质分子之间原有电荷的差异。所以,蛋白质的迁移率仅取决于蛋白质的分子质量的大小。与已知分子质量的标准品比较,可以测定蛋白质的分子质量。

SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围,取决于用于灌胶的聚丙烯酰胺的浓度和交联度。在没有交联剂的情况下聚合的丙烯酰胺形成毫无价值的黏稠溶液,而经双丙烯酰胺交联后凝胶的刚性和抗张强度都有所增加,并形成SDS-蛋白质复合物必须通过的小孔。这些小孔的孔径随“双丙烯酰胺/丙烯酰胺”比率的增加而变小,比率接近1∶20时孔径达到最小值。SDS聚丙烯酰胺凝胶大多按“双丙烯酰胺/丙烯酰胺”为1∶29配制,实验表明它能分离大小相差只有3%的蛋白质。

凝胶的筛分特性取决于它的孔径,而孔径又是灌胶时所用丙烯酰胺和双丙烯酰胺绝对浓度的函数。用5%~15%的丙烯酰胺所灌制凝胶的线性分离范围如表5-11所示。

表5-11 SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围

*双丙烯酰胺/丙烯酰胺摩尔比为1∶29。

二、基本操作

王大虎
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SDS-PAGE操作与上述PAGE的操作大体相似,其不同之处有:

1.电泳前的样品处理

按表5-12的配方,配制一定量的二倍样品缓冲液,在4℃条件下可储存数月。每次使用前,样品与样品缓冲液以1∶1进行混合,煮沸5min,离心,作为点样用。

表5-12 SDS-PAGE电泳溶液的配制

2.电泳溶液的配方

SDS-PAGE电泳溶液的配方见表5-12,分离胶溶液和浓缩胶溶液配方分别见表5-13,其他同常规PAGE。

表5-13 分离胶及浓缩胶的配制

三、应用

应用SDS-PAGE可测定蛋白质的分子质量,对蛋白质组分进行分离、分析、纯化、定性、定量以及少量的制备。相对于超离心、色谱、渗透法等,SDS-PAGE是测定蛋白质亚基分子质量的一种简单、经济、快捷的方法。

王大虎(一)蛋白质组分的分离

采用SDS-PAGE法对猪皮酶水解胶原蛋白产物进行分离,可以对样品进行较好的分离,得到较清晰的分离图谱。其实验条件为:采用Tris-甘氨酸电极缓冲液X,考马斯亮蓝加甲醇-冰乙酸的染色液和甲醇-冰乙酸脱色液X,分离胶浓度为10%,浓缩胶浓度为4%的不连续凝胶系统,样品浓度为0.1g/mL,上样量为4~10µL。

王大虎 (二)蛋白质组分分析

唐晓琳等通过SDS-PAGE法分析成人牙周炎患者唾液蛋白成分,并对牙周基础治疗前后唾液蛋白成分的改变进行观察,以期初步筛选与牙周炎相关的蛋白因子。对牙周炎与正常对照组全唾液电泳进行分析,如图5-9所示。

图5-9 全唾液SDS-PAGE分析(银染色)

1~3与4~6—分别为两位急性胰腺炎患者治疗前、后2周、4周蛋白图谱 7、8—正常对照 9—分分子质量标准

G1—大的糖性碱性富脯蛋白 Amy—α-淀粉酶 B—糖性富脯蛋白 Ps2和Ps1—碱性分子质量多态性富脯蛋白 C和A—酸性富脯蛋白 IB1~IB9—碱性富脯蛋白 His—富组蛋白样碱性多肽 X—性质不明富脯蛋白

(资料来源:唐晓琳,2003)

(三)鉴定蛋白质纯度

邵彪等从黑豆中分离纯化出抗真菌蛋白,经SDS-PAGE鉴定已达到电泳纯,如图5-10所示。图中DTT是SDS-PAGE电泳样品的还原处理液。DTT-和DTT+均表现为单一条带,可以判断这个抗菌蛋白为单链蛋白,并且在其分子内不存在由2个半胱氨酸形成二硫键的结构。

图5-10 SDS-PAGE鉴定黑豆中抗真菌蛋白纯度

(资料来源:邵彪,2007)

第四节 等电聚焦

等电聚焦(isoelectric focusing, IEF)是20世纪60年代中期问世的一种利用有pH梯度的介质分离不同等电点的蛋白质的电泳技术。在IEF中,蛋白质分子在含有载体两性电解质形成的一个连续而稳定的线性pH梯度中电泳。由于其分辨率可达0.01pH单位,因此特别适合于分离分子质量相近而等电点不同的蛋白质组分,但是对于在等电点时发生沉淀或变性的样品却不适用。

王大虎一、基本原理

IEF的关键是在凝胶中形成稳定的、连续的线性pH梯度。根据建立的pH梯度原理的不同,可分为载体两性电解质pH梯度的IEF和固相pH梯度的IEF。前者是将载体两性电解质溶解在电泳介质溶液中制胶,形成聚丙烯酰胺或琼脂凝胶,然后将凝胶引入电场中进行IEF。后者是将弱酸、弱碱两性基团直接引入丙烯酰胺中,在凝胶聚合时形成pH梯度,因此其pH梯度固定,不随环境电场等条件变化。

以载体两性电解质pH梯度的IEF为例,在IEF的电泳中,具有pH梯度的介质其分布是从阳极到阴极,pH逐渐增大。蛋白质分子具有两性解离及等电点的特征,这样在碱性区域蛋白质分子带负电荷向阳极移动,直至某一pH位点时失去电荷而停止移动,此处介质的pH恰好等于聚焦蛋白质分子的等电点(pI)。同理,位于酸性区域的蛋白质分子带正电荷向阴极移动,直到它们的等电点上聚焦为止。可见在该方法中,等电点是蛋白质组分的特性量度,将等电点不同的蛋白质混合物加入有pH梯度的凝胶介质中,在电场内经过一定时间后,各组分将分别聚焦在各自等电点相应的pH位置上,形成分离的蛋白质区带。

王大虎 pH梯度的组成方式有两种,一种是人工pH梯度,由于其不稳定,重复性差,现已不再使用。另一种是天然pH梯度。天然pH梯度的建立是在水平板或电泳管正负极间引入等电点彼此接近的一系列两性电解质的混合物,在正极端吸入酸液,如X、磷酸或醋酸等,在负极端引入碱液,如NaOH、氨水等。电泳开始前两性电解质的混合物pH为一均值,即各段介质中的pH相等,用pH0表示。

电泳开始后,混合物中pH最低的分子,带负电荷最多,pI1为其等电点,向正极移动速度最快,当移动到正极附近的酸液界面时,pH突然下降,甚至接近或稍低于pI1,这一分子不再向前移动而停留在此区域内。由于两性电解质具有一定的缓冲能力,使其周围一定的区域内介质的pH保持在它的等电点范围。pH稍高的第二种两性电解质,其等电点为pI2,也移向正极,由于pI2>pI1,因此定位于第一种两性电解质之后,这样,经过一定时间后,具有不同等电点的两性电解质按各自的等电点依次排列,形成了从正极到负极等电点递增,由低到高的线性pH梯度,如图5-11所示。

图5-11 用两性电解质建立电场中连续线性pH梯度

(资料来源:B. D. 哈密斯,1994)

 

 

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