大虎说事

王大虎:IEF电泳凝胶的制备

蒸馏水2.62mL、IEF琼脂糖0.06g和山梨醇0.76g在沸水浴中加热约20min至完全溶解,如有残留颗粒会影响电泳效果。迅速加入尿素1.9g、硫脲0.48g至全溶,轻轻搅拌均匀,然后迅速加入两性电解质(pH3.5~10)(477µL)混匀,放置数分钟消泡,注意防止固化。混合液用注射器加入电泳管中,至内标线为止,在灌制过程中胶管头应始终保持在液面下,不能产生气泡。在液面上加入50µL重层液,注意不能扰乱界面。5~10℃,放置4h到一夜固化备用。固化后于5~10℃可保存5个月,凝胶干后不能再用。

王大虎  2.样品处理

用1mL样品处理液溶解10mgDTT,按样品体积的10倍加入样品处理液,4℃,10000r/min离心5min。

3.聚焦

去除IEF管里的重层液,加入样品,上样上限为50µL;沿管壁加入10µL重层液,再加入100µL上部电极液至管口,加时要慢不能扰乱界面,整个管内不能有气泡,否则影响电泳效果;在下部槽中加入500~550mL下部电极液,上部槽中加入40mL上部电极液开始等电聚焦,泳动电压300V,泳动时间150min。

4.固定和染色

电泳后,不可用染色剂直接染色,因为常用的蛋白质染色剂也能和两性电解质结合,因此应先将凝胶浸泡在5%的三氯乙酸中去除两性电解质,然后再以适当的方法染色。测量蛋X到酸端的距离,以及胶条的总长度。

王大虎 5.等电聚焦标准曲线

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预留一根制备好的胶不加样品,其他步骤与加样品的胶操作相同,同时进行等电聚焦。聚焦完毕,胶柱两端和玻璃管外壁用蒸馏水洗涤三次,以免污染电极液而影响真实pH,从玻璃管中取出胶柱,用刀片以0.5cm的长度分段切下,按次序分别浸入4mL、0.01mol/L的KCl中,4℃过夜。置室温平衡后,测出各段的pH,如图5-12所示。以各段胶所在的位置与胶条长度的比值为横坐标,以相应的浸泡液pH为纵坐标做图,可得胶柱的pH梯度曲线。

 

6.等电点的测定

根据加样胶柱上的染色位置与胶条总长的比值,与标准曲线图相比,即可测出蛋白质的等电点。

 

三、应用

利用IEF技术,可对蛋白质组分进行分离、分析、纯化、定性、定量以及制备,最广泛应用于测定蛋白质的等电点。

如图5-13所示,用标准蛋白质的等电点(作为纵坐标)对其在IEF中移动的距离(作为横坐标)作图,即可得到标准的等电点曲线图。当测定未知蛋白质的等电点时,只要在同样的IEF条件下求出其移动距离,就可以从等电点曲线图中查出相应的等电点。

图5-13 等电点标准曲线图

(资料来源:B. D. 哈密斯,1994)

这种方法测定等电点的不足之处是,有些蛋白质会与两性电解质载体发生可逆性结合,形成虚假的多重谱带,故应用此方法鉴定蛋白质纯度时必须注意。在等电聚焦时,改变加样部位,或改变凝胶中两性电解质的浓度,电泳图谱不会发生改变。另外,等电聚焦形成的单一谱带再进行等电聚焦,其仍为单一谱带时,则表明两性电解质载体和待测样品组分并不相互作用。

王大虎 第五节 双向电泳

双向电泳全称为PAGE双向电泳,是一种由任意两个单向PAGE组合而成的、在第一向电泳后继而在其垂直方向进行第二向电泳的分离方法。1975年0’Farrall等人根据不同组分之间的等电点差异和分子质量差异建立了IEF/SDS-PAGE双向电泳。IEF/SDS-PAGE双向电泳对蛋白质(包括核糖体蛋白、组蛋白等)的分离是极为精细的,因此特别适合于分离细菌或细胞中复杂的蛋白质组分。“蛋白质组”即指某一生物系统中的所有蛋白质组分。通过蛋白组学分析,可以在蛋白质水平上对不同蛋白进行定性和定量分析,从而比较不同的蛋白质组。细胞提取液的二维电泳可以分辨出1000~2000个蛋白质,有些报道可以分辨出5000~10000个斑点,这与细胞中可能存在的蛋白质数量接近。由于二维电泳具有很高的分辨率,它可以直接从细胞提取液中检测某个蛋白质。例如将某个蛋白质的mRNA转入到青蛙的卵母细胞中,通过对转入和未转入细胞提取液的二维电泳图谱的比较,转入mRNA的细胞提取液的二维电泳图谱中应存在一个特殊的蛋白质斑点,这样就可以直接检测mRNA的翻译结果。

一、基本原理

IEF/SDS-PAGE双向电泳中通常第一维电泳是IEF,在细管(φ1~3mm)中加入含有两性电解质、8mol/L的尿素以及非离子型去垢剂的聚丙烯酰胺凝胶进行IEF,变性的蛋白质根据其等电点的不同进行分离。在第二维的电泳过程中,结合SDS的蛋白质从等电聚焦凝胶中进入SDS-聚丙烯酰胺凝胶,在浓缩胶中被浓缩,在分离胶中依据分子质量大小被分离。这样各个蛋白质根据等电点和分子质量的不同而被分离(图5-14)。

图5-14 双向电泳原理示意图

(资料来源:B. D. 哈密斯,1994)

样品制备是双向电泳过程中的第一步,也是重要的一步。理想情况下,要进行研究的生物样品中的所有蛋白质都应是已溶解的,否则由于样品在缓冲液中缓慢溶解,而可能出现明显的条纹。

二、基本操作

王大虎 下面以分离PC12细胞蛋白质组分为例,详述其操作过程。

(一)溶液配制

见表5-14,表5-15。

表5-14 溶液配方

表5-15 双向电泳溶液的配制

(二)操作步骤

1.第一向IEF(用自制的水化上样缓冲液,17cm的胶条,pH4~7)

①从冰箱中取-20℃冷冻保存的水化上样缓冲液(I)(不含DTT,不含Bio-Lyte)一小管(1mL/管),置室温溶解。

②在小管中加入0.01g DTT,Bio-Lyte 4~6、5~7各2.5µL,充分混匀。

③从小管中取出400µL水化上样缓冲液,加入100µL样品,充分混匀。

④从冰箱取-20℃冷冻保存的IPG预制胶条(17cm pH4~7),于室温放置10min。

⑤沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品。在槽两端各1cm左右不要加样,中间的样品液一定要连贯。注意:不要产生气泡。否则影响到胶条中蛋白质的分布。

⑥当所有的蛋白质样品都已经加入到聚焦盘或水化盘中后,用镊子轻轻的去除预制IPG胶条上的保护层。

⑦分清胶条的正负极,轻轻地将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘或水化盘中样品溶液上,使得胶条的正极(标有+)对应于聚焦盘的正极。确保胶条与电极紧密接触。不要使样品溶液弄到胶条背面的塑料支撑膜上,因为这些溶液不会被胶条吸收。同样还要注意不使胶条下面的溶液产生气泡。如果已经产生气泡,用镊子轻轻地提起胶条的一端,上下移动胶条,直到气泡被赶到胶条以外。

⑧在每根胶条上覆盖2~3mL矿物油,防止胶条水化过程中液体的蒸发。需缓慢的加入矿物油,沿着胶条,使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上。

⑨对好正、负极,盖上盖子。设置IEF程序。

⑩聚焦结束的胶条。立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳,否则将胶条置于样品水化盘中,-20℃冰箱保存。

2.第二向SDS-PAGE电泳

①配制10%的丙烯酰胺凝胶两块。配80mL凝胶溶液,每块凝胶40mL,将溶液分别注入玻璃板夹层中,上部留1cm的空间,用MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇封面,保持胶面平整。聚合30min。一般凝胶与上方液体分层后,表明凝胶已基本聚合。待凝胶凝固后,倒去分离胶表面的MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇,用MilliQ水冲洗。

②从-20℃冰箱中取出的胶条,先于室温放置10min,使其溶解。

③配制胶条平衡缓冲液Ⅰ。在桌上先放置干的厚滤纸,聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。将另一份厚滤纸用MilliQ水X,挤去多余水分,然后直接置于胶条上,轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品。这可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。将胶条转移至溶胀盘中,每个槽一根胶条,在有胶条的槽中加入5mL胶条平衡缓冲液Ⅰ。将样品水化盘放在水平摇床上缓慢摇晃15min。

④配制胶条平衡缓冲液Ⅱ。

⑤第一次平衡结束后,彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液Ⅰ。并用滤纸吸取多余的平衡液(将胶条竖在滤纸上,以免损失蛋白质或损坏凝胶表面)。再加入胶条平衡缓冲液Ⅱ,继续在水平摇床上缓慢摇晃15min。用滤纸吸去聚丙烯酰胺凝胶上方玻璃板间多余的液体。将处理好的第二向凝胶放在桌面上,长玻璃板在下,短玻璃板朝上,凝胶的顶部对着自己。将琼脂糖封胶液进行加热熔解。将10×电泳缓冲液,用量筒稀释10倍,成1×电泳缓冲液。赶去缓冲液表面的气泡。

⑥第二次平衡结束后,彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液Ⅱ。并用滤纸吸取多余的平衡液(将胶条竖在滤纸上,以免损失蛋白质或损坏凝胶表面)。将IPG胶条从样品水化盘中移出,用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸没在1×电泳缓冲液中。然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上。其余胶条同样操作。将放有胶条的SDS-PAGE凝胶转移到灌胶架上,短玻璃板一面对着自己。在凝胶的上方加入低熔点琼脂糖封胶液。用镊子、压舌板或是平头的针头,轻轻地将胶条向下推,使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触。注意不要在胶条下方产生任何气泡。在用镊子、压舌板或平头针头推胶条时,要注意是推动凝胶背面的支撑膜,不要碰到胶面。

⑦放置5min,使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝固。在低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后,将凝胶转移至电泳槽中。

⑧在电泳槽加入电泳缓冲液后,接通电源,起始时用的低电流(5mA/gel/17cm)或低电压,待样品在完全走出IPG胶条,浓缩成一条线后,再加大电流(或电压)(20~30mA/gel/17cm),待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。电泳结束后,轻轻撬开两层玻璃,取出凝胶,并切角以作记号(戴手套,防止污染胶面)。

⑨进行染色。

3.凝胶图像扫描与分析

将电泳胶在20%三氯乙酸中固定1h,蒸馏水冲洗,用考马斯亮蓝染液染色。使用10%乙酸脱色,并用图像扫描仪收集胶图,用Image Master 2D Evolution软件对所得的图像找点、背景削减和匹配。

4.蛋白质鉴定

切胶仪切取蛋白质点,经脱色、干燥后加入20µg/L胰酶,37℃作用2h。以50%乙腈-0.5%三氟乙酸溶解肽段及等体积饱和CCA(2-氰基-4-羟基肉桂酸)与之混匀,点靶仪点样。MALDI-TOF MS进行蛋白质肽质量指纹图谱分析,并进行蛋白质数据库检索。

三、应用

双向电泳不仅能同时测定蛋白质的等电点、分子质量,更重要的是它还可用于了解蛋白质混合物的组成及变化,如不同细胞、亚细胞中的蛋白质组成及含量差异,从而在临床诊断、病理研究、药物筛选、新药开发、食品检测、甚至物种鉴定等研究中做出了重大贡献。例如,X等利用二维电泳图谱研究PC12细胞蛋白质组学,用Image Master 2D Evolution软件对所获的图谱进行分析,共得蛋白点(879±24)个。在等电点4~7、相对分子质量20000~66000的区域,蛋白点丰富;而在酸性端和碱性端,蛋白点少。PC12细胞的二维电泳图谱见图5-15。

图5-15 PC12细胞蛋白的二维电泳图谱

上切取配对良好、散在分布的蛋白质点45个,进行质谱鉴定,得到可信鉴定结果19个,具体胶上分布见图5-15。蛋白质的具体结果见表5-16,包括蛋白质的NCBI检索号码、理论等电点及相对分子质量,其中等电点及相对分子质量是根据肽质量得到蛋白质的理论值。图5-15与表5-16中的数字相互对应。另外,在胶上可见到两个蛋白点均鉴定为19号蛋白,即热源蛋白27,这可能是由于翻译后修饰所致。图5-16所示为19号蛋白点(热源蛋白27)的具有代表性的肽质量指纹质谱图,其中X轴为质核比(m/z),Y轴为相对丰度。

表5-16 PC12细胞经MALDI-TOF MS的鉴定结果

图5-16 19号蛋白点(热休克蛋白27)的肽质量指纹质谱图

所鉴定出的19个蛋白质功能多样,这些蛋白质从功能上分成以下几类:分子伴侣及相关功能蛋白、细胞结构/骨架蛋白、代谢相关蛋白、凋亡相关蛋白、激素结合相关蛋白、神经内分泌相关蛋白,这些蛋白质建立了PC12细胞的部分蛋白质数据库。从胶图上可以看出,丰度最大的点主要集中在分子伴侣及相关功能蛋白和细胞结构/骨架蛋白上,体现了这两类蛋白质在细胞内的功能重要性。同时这些蛋白在胶上散在分布,为以PC12细胞为对象的蛋白质组学研究确立了标志蛋白。

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