王大虎

王大虎:毛细管电泳

王大虎 一、基本原理

毛细管电泳(Capillary Electrophoresis, CE)是20世纪80年代初迅速发展起来的一种分离分析技术,是以高压电场为驱动力,以毛细管为分离通道,依据样品中各组成之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的一类液相分离技术。仪器装置包括高压电源、毛细管、柱上检测器和供毛细管两端插入又同电源相连的两个缓冲液贮瓶。毛细管电泳所用的石英毛细管在pH>3时,其内液面带负电,和溶液接触形成一双电层。在高电压作用下,双电层中的水合阳离子层引起溶液在毛细管内整体向负极流动,形成电渗液。带电粒子在毛细管内电解质溶液中的迁移速度等于电泳和电渗流(EOF)二者速度的矢量和。带正电荷粒子最先流出;中性粒子的电泳速度为“零”,故其迁移速度相当于EOF速度;带负电荷粒子运动方向与EOF方向相反,因EOF速度一般大于电泳速度,故它将在中性粒子之后流出;各种粒子因迁移速度不同而实现分离。

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王大虎 二、分离模式

CE将经典电泳技术和现代微柱分离有机地结合,取得了比高效液相色谱(HPLC)和平板凝胶电泳更多的优点。概括起来可谓“三高二少一广”。高质量灵敏度:常用紫外检测器检测限可达10-15~10-13mol,激光诱导荧光检测(LIF)器则达10-21~10-19mol。高分辨率:每米理论塔板数为几十万,高者可达几百万乃至几千万。高速度:许多分析可在几十秒内完成。所需样品少:只需纳升(10-9L)的进样量。成本低:只需少量的流动相和价格低廉的毛细管。应用范围广;除分离生物大分子外,还可用于小分子(氨基酸、药物等)及离子(无机及有机离子)。甚至可分离各种颗粒(如细胞、硅胶颗粒等)。

毛细管电泳根据不同的分离机制,有多种分离模式,并适用不同场合。

王大虎 (一)毛细管区带电泳

毛细管区带电泳(Capillary Zone Electrophoresis, CZE)也称X溶液毛细管电泳(Free Solution Capillary Electrophoresis, FSCE),其分离机理是基于各被分离物质的净电荷与其质量比(荷质比)间的差异。毛细管中充满了电泳缓冲液后,带电的样品分子根据粒子淌度不同而实现分离。对于中性粒子,由于它们之间没有淌度差异,都和电渗流共迁移而不能分开。目前CZE仍是毛细管电泳中最基本、应用最多的模式,应用范围包括氨基酸、多肽、蛋白质、离子、对映体拆分和很多其他带电物质的分离。

CZE具有与反相HPLC不同的分离机理,且其理论塔板系数不亚于后者,尤其对于亲X肽的分离分析具有一定的优越性。影响CZE的最主要因素是缓冲液的成分和pH。在合适的电泳条件下,CZE可以分辨多肽的细微结构差异,如C末端的酰胺化与去酰胺化,单个氨基酸残基的替换,氨基酸组成相同而序列不同的多肽也能区别开,甚至表面电荷不同而一级结构相同的多肽也有可能分离开。

王大虎 (二)胶束电动毛细管色谱

胶束电动毛细管色谱(Micellar Electrokinectic Capillary Chromatography, MECC)在某种程度上与反相HPLC类似,在电泳缓冲液中添加一定浓度的表面活性剂,当浓度高于其临界浓度时,表面活性剂分子就会发生聚集,形成微团或胶束。其中疏水部分在内部,亲水部分在表面,称为准固定相。常用表面活性剂有各种阴离子表面活性刑、阳离子表面活性剂、非离子和两性表面活性剂。也有用混合胶束,如阴离子表面活性剂和胆酸盐组成混合胶束。有报道采用脂肪醇的微乳液胶束电动色谱(MEEKC)有比MECC更高的柱效、更快的分析速度和容易控制“窗口”。表5-17列出了常用的表面活性剂。

表5-17 常用的表面活性剂

 

续表

 

例如,当采用表面活性剂SDS时,在运动缓冲液内形成一疏水内核、外部带负电的动态胶束相。利用溶质具有不同的疏水性,电渗流作用下迫使胶束以较低的速度向负极移动,这种移动的固定相称为准固定相。各种分子(包括中性分子)根据在准固定相和溶液相中的分配不同而分离。这是一种既能分离中性溶质又能分离带电组分的CE模式。

MECC弥补了毛细管区带电泳分离模式的不足,不仅可以测定荷电粒子,而且可以测定中性粒子。可以同时分离带电荷与不带电荷的分子,被较多的应用于氨基酸衍生物、肽谱分析以及合成多肽纯度鉴定等。MECC模式中常可加入有机修饰剂,如:甲醇、乙腈、异丙醇等,降低溶质和微团间的疏水吸附,也可减少形成微团的疏水作用。

(三)毛细管筛分电泳

毛细管筛分电泳(Capillary Sieving Electrophoresis, CSE)中毛细管内填充筛分介质,通过分子筛作用影响不同大小分子的移动速度,筛分介质有凝胶和非凝胶材料两大类。

凝胶材料常以化学共价或交联方式形成胶状多孔物质,如交联聚丙烯酰胺、琼脂糖等,这类CE称毛细管凝胶电泳(Capillary Gel Electrophoresis, CGE)。它是将平板电泳的凝胶移到毛细管中作支持物进行电泳,不同体积的溶质分子在起“分子筛”作用的凝胶中得以分离。常用于蛋白质、寡聚核苷酸、RNA、DNX段的分离。其分离效率高,但毛细管柱制备困难、凝胶容易断裂和产生空泡、稳定性差、柱寿命短且重现性不好。

非凝胶材料即非交联的高分子溶液,在浓度足够大时形成多孔结构,如纤维素及其衍生物、未聚合的丙烯酰胺等,这类则称毛细管无胶筛分电泳(Capillary No Gel Sieving Electrophoresis, CNGSE),无复杂的凝胶制备过程,溶液易于充入和洗出、操作简单、可重复使用且易于实现自动化分离。

(四)毛细管等电聚焦

毛细管等电聚焦(Capillary Isoelectric Focusing, CIEF)用两性电解质在毛细管内建立pH梯度,使各种具有不同等电点的蛋白质在电场作用下迁移到等电点的位置,形成窄的聚焦区带。

在CIEF过程中,X中性共价涂层使毛细管电渗流尽可能减小,阳极端至检测器有效分离部分(离检测窗口差几厘米)充满两性电解质溶液,样品溶液夹在其中以避免直接接触阳极液。毛细管其余部分(检测器至阴极)为阴极液。毛细管两端分别插入阳极液和阴极液中,其中毛细管中的溶液和样品溶液中均含一定浓度的可溶性甲基纤维素作为支持介质。两性电解质载体和样品在电场中聚焦至电流趋于零。此时可采用真空抽吸、压力推动或者在电极液中加入盐,以改变已经形成的pH梯度等方式驱使蛋白质条带移动并逐一经过检测窗口。

CIEF分辨率高,已成功地用于在线分析多肽的等电点,还可以分离异构体甚至可用于分析差异较小的异构体等。如用CZE和CIEF研究制备过程中糖蛋白不同糖基化程度引起的非均一性,结果表明CIEF方法要比CZE的好,对于较稀的蛋白质溶液(低至0.001µg/µL)也可以分析。

(五)毛细管等速电泳

毛细管等速电泳(Capillary Isotachophoresis, CITP)采用两种不同电解质溶液。一种是前导电介质,充满整个毛细管,淌度高于样品组分;另一种是尾随电介质,置于一端电解槽,淌度低于样品组分。样品组分按照其不同淌度夹在中间,使溶质按其电泳淌度不同得以分离的方式。

当电泳达到平衡后,各迁移率不同的离子前后相随,各区带与前导介质等速移动。此时若有区带间脱节,其间阻抗趋于无穷大,在恒流源作用下电场迅速增强,迫使后一区带迅速跟上,保持恒定。CITP有速度恒定、区带锐化、区带浓缩等特点。现在常用作柱前浓缩方法用以富集样品,以解决CE测定中浓度与灵敏度不成比例的问题。

(六)毛细管电色谱

毛细管电色谱(Capillary Electrochromatography, CEC)是将HPLC中众多的固定相微粒填充到毛细管中或涂渍到管壁,以样品与固定相之间的相互作用为分离机制,以电渗流为流动相驱动力的色谱过程。例如,近年发展起来的一种高效、快速的新型微柱分离方法——开管毛细管电色谱,即在毛细管管壁涂布或键合固定相,以电渗流驱动流动相的一种色谱分离模式。CEC将CE的高效和HPLC的高选择性相结合,得到了CE研究者的青睐。此模式兼具毛细管电泳和高效液相的优点,不仅可以同时分离带电与中性分子,而且通过控制分离条件可实现更好的分离效率。目前已在硅胶、氰基、胺基、硅胶键合十八烷基(ODS)、阴离子交换树脂、阳离子交换树脂等10余种填料CEC柱上进行研究,开管CEC也发展了一些新技术,如硅胶-溶胶法在管壁涂渍C8固定相,分子印刷法分离手性化合物。

此外如亲和毛细管电泳、免疫毛细管电泳发展趋势也较好。例如ACE,是在毛细管X涂布或在凝胶中加入亲和配基,以亲和力的不同达到分离,可用于研究抗原-抗体或配体-受体等特异性相互作用的结合常数和结合位点数。

(七)非水毛细管电泳

CE通常是在水溶液中进行的,常用介质为电解质水溶液。使用有机溶剂替代水介质来完成特殊样品的电泳分离,即非水毛细管电泳(Nonaqueous Capillary Electrophoresis, NACE)。非水毛细管电泳根据情况在水溶液中加入不同有机溶剂或其他添加剂,如在乙腈中加入嗡盐(tropyltum)来分离多环芳烃化合物,现在发展到可不加支持电解质,直接用乙腈、甲酰胺、甲醇等作溶剂来进行NACE。

NACE使用有机溶剂替代水介质来完成特殊样品的电泳分离,拓宽了CE的应用范围,可用于分析不易溶于水而易溶于有机溶剂的物质,及在水溶剂CE中淌度十分相似的物质,并可研究水中难以发生的反应等。这种分离模式具有灵敏度高、改善分离、减少毛细管X吸附等优点。目前,NACE应用的研究热点集中在有机溶剂、电解质、检测器的选择以及方法的优化等方面。

 

 

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